[發明專利]一種融合蛋白CR2-Linker-GDH及其應用

在審

• 申請號: 201510001375.4
• 申請日: 2015-01-04
• 公開（公告）號: CN104450637A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 穆曉清;徐巖
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種融合蛋白CR2-Linker-GDH及其應用，屬于基因工程和生物催化技術領域。

背景技術

手性醇類化合物是一類醫藥/食品/農藥化學/精細化工/化妝品等領域的重要中間體。光學純的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE]是合成降膽固醇藥物阿托伐他汀(Atovastatin)/羥甲基戊二酸甲酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑及生物堿SlageninsB和C等藥物的前體物質。在其的生產方法中，生物法具有反應條件溫和/反應步驟少等優勢，且該方法具有很強的立體和對映選擇性。

通過氧化還原酶進行生物轉化的理論收率可以達到100％，但是在氧化還原酶的應用中，除了需要合適的酶外，還需要提供高效/低成本的輔酶再生系統。輔酶的生物法再生通常包括酶耦聯法和底物耦聯法，其中酶耦聯法是利用兩個平行的氧化還原反應酶系統，一個酶催化底物轉化，另一個酶則催化輔酶循環再生。

在傳統的酶耦聯法再生體系中，需要分別添加底物催化酶和輔酶循環酶兩種酶，操作麻煩，成本高，且輔酶在兩個酶分子間傳遞，有可能造成輔酶再生效率不高。利用融合策略構建人工酶有可能使兩個酶的活性位點接近，從而提高催化效率。

亞磷酸脫氫酶(PTDH)能以廉價的亞磷酸鹽作為底物實現NADPH的再生，Torres等構建了一系列B-V單加氧酶(BVMOs)和PTDH的融合酶，在NADP濃度只有5umol/L時，仍能實現苯丙酮到乙酸芐酯的有效轉化(79％，3h)，融合后各個酶都能保持天然酶的催化活性。H?lsch等構建了甲酸脫氫酶(FDH)和3-酮酰基-ACP還原酶(KR)的融合酶進行手性醇生產，與兩個酶混合物相比，初始催化速度提高了2倍，底物轉化率能達到99.97％，并且具有極高的光學選擇性(99.9％(S)-1-(pentafluorophenyl)ethanol)。

本發明構建了一種融合蛋白，同時具備羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的活性，以一定濃度的4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)為底物，葡萄糖為輔助底物，利用融合蛋白進行生物轉化反應，實現了催化和輔酶循環的雙重功能。

發明內容

本發明的目的是提供一種融合蛋白，同時具備羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的活性，本發明利用基因工程技術實現兩種酶蛋白的融合，實現了雙酶功能的成功整合。利用該融合蛋白為催化劑可不對稱轉化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。

所述羰基還原酶的氨基酸序列是SEQ?ID?NO.1所示的序列。

所述葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列是SEQ?ID?NO.2所示的序列。

編碼所述羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列之間連接有寡肽接頭：(GGGGS)₃。

在本發明的一種實施方式中，所述寡肽接頭為柔性的寡肽接頭(GGGGS)₃。

所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQ?ID?NO.3所示的序列。

編碼所述融合蛋白的基因的核苷酸序列是SEQ?ID?NO.4所示的序列。

本發明還提供一種表達所述融合蛋白的重組大腸桿菌。

本發明還提供一種所述融合蛋白在制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯方面的應用。

所述應用，在本發明的一種實施方式中，是以COBE為底物，葡萄糖為輔助底物，融合蛋白為催化劑，添加定量的NADP⁺，進行不對稱轉化反應，得到(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。

所述應用，在本發明的一種實施方式中，是以COBE為底物，在30℃，pH?5.5的醋酸緩沖液中，加入7U融合蛋白CR2，0.05mmol/LNADP⁺，反應90min。該實施方式是優化反應條件的實施方式，在該實施方式下產率為100％。

本發明通過將羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶兩個酶的編碼基因融合表達，實現這兩個酶的偶聯，成功構建的重組菌的融合蛋白表達量可達到0.143g/g(蛋白/菌體)。本發明的融合蛋白的羰基還原酶的Km是沒有發生融合的單一的羰基還原酶Km的1.4倍，對底物COBE的Vmax為58.82μmol/min*mg比單一蛋白的Vmax值50.66提高了16％，催化效率k_cat/Km是單一蛋白CR2催化效率的2.8倍。