[發明專利]一種核酸單鏈環狀文庫的構建方法和試劑

有效

• 申請號: 201480081853.0
• 申請日: 2014-11-26
• 公開（公告）號: CN108138364B
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發明（設計）人: 耿春雨;陳若瑩;江媛;趙霞;郭榮榮;賀玲瑜;李雅喬;章文蔚;蔣慧;拉多杰·德馬納克
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6806;C12Q1/6855;C12Q1/6853
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

1.一種核酸單鏈環狀文庫的構建方法，包括如下步驟：

使用轉座酶包埋復合體對核酸進行隨機打斷，其中所述轉座酶包埋復合體包含轉座酶和含轉座酶識別序列的第一接頭，打斷的核酸兩端連接所述第一接頭并且形成缺口；

去除體系中的轉座酶，然后使用連接酶在所述缺口處連接上第二接頭，所述第二接頭的序列不同于所述第一接頭；

進行第一PCR反應，得到兩端分別連接第一接頭和第二接頭序列的產物，其中所述第一PCR反應的引物上帶有U堿基；

使用User酶酶切U堿基位點產生切口，然后進行雙鏈環化產生環狀核酸分子；

以所述環狀核酸分子為模板，從所述切口處開始進行限制性缺口平移反應；

消化除去所述環狀核酸分子上的未發生限制性缺口平移反應的部分，得到線性核酸分子；

在所述線性核酸分子每條鏈的3’端連接第三接頭，并在每條鏈的5’端連接寡核苷酸接頭序列；

進行第二PCR反應，得到兩端分別連接第三接頭和寡核苷酸接頭序列的產物，其中所述第二PCR反應的一條引物在5’端具有第一親和標記；

使用帶有第二親和標記的載體結合所述產物，并通過核酸變性分離出不帶親和標記的核酸單鏈，其中所述第二親和標記結合所述第一親和標記；

使用單鏈環化“橋”序列對所述核酸單鏈進行環化，其中所述單鏈環化“橋”序列能夠同時結合所述核酸單鏈的兩端。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在使用單鏈環化“橋”序列對所述核酸單鏈進行環化后，還包括：對未環化的核酸單鏈進行消化。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述去除體系中的轉座酶，采用磁珠純化、過柱純化或化學試劑處理的方式進行。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述限制性缺口平移反應過程中，通過控制體系中dNTP的量來控制所述限制性缺口平移反應生成的片段的長度。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述限制性缺口平移反應之前，對未環化的核酸分子進行消化。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化除去所述環狀核酸分子上的未發生限制性缺口平移反應的部分，具體包括：首先使用雙鏈外切酶降解，直到兩端的缺口相遇；然后使用單鏈外切酶降解單鏈。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述線性核酸分子每條鏈的3’端連接第三接頭之前，還包括：對所述線性核酸分子進行末端補平和去磷酸化反應。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在所述線性核酸分子每條鏈的3’端連接第三接頭之后，對5’端進行磷酸化，然后在每條鏈的5’端連接寡核苷酸接頭序列。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸接頭序列在鄰近連接的片段的部分與所述第三接頭有部分堿基互補。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一親和標記為生物素標記；所述第二親和標記為鏈霉親和素標記。