[發明專利]用于使用CARS顯微術分析樣本的方法

有效

• 申請號: 201480064297.6
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN105793693B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: B·賽格米勒
• 申請（專利權）人: 徠卡顯微系統復合顯微鏡有限公司
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 王勇;王博

公開了一種用于使用CARS顯微術來分析樣本(1)的方法，所述樣本(1)從生物源獲得。在所述方法中，使用相干反斯托克斯拉曼散射通過激光輻射激勵樣本(1)中的至少一個諧振點(5)而生成的諧振信號以圖像產生的方式被捕獲。所公開的方法包括通過使樣本(1)的內在化學結構(2)經歷與至少一個反應搭檔(3,6)的生物正交反應來創建至少一個諧振點(5)。

技術領域

本發明涉及根據權利要求1的前序部分的用于使用CARS顯微術研究從生物源獲得的樣本的方法。

背景技術

“非線性拉曼光譜術”被理解為指基于光在固體或氣體處的非線性拉曼散射的光譜研究方法。本發明涉及基于相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的顯微研究方法。

針對這種研究方法(也稱為“CARS顯微術”)，使用發射不同波長的光(v_P和v_S，泵浦和斯托克斯光束)的兩個激光器來生成CARS光譜v_CARS:v_CARS＝2v_P-v_S,I_CARS≈(I_P)²-I_S，其中，v_S應當是可調諧的。

圖2示意性地示出了CARS過渡的譜項圖。如果頻率差v_P-v_S匹配所研究樣本中的兩個分子振動狀態|1>和|0>之間的頻率差，則CARS信號被放大。其中這種不同的分子狀態發生并且也相應地可探測到的樣本的結構(通常為特征化學鍵)在以下被稱為“諧振部位”。通常包含它們的一個或多個分子的相應結構也被稱為“散射體”。

泵浦光束和斯托克斯光束同軸地組合用于顯微術應用，并且被一起聚焦在相同的樣本體積上。反斯托克斯輻射被發射的方向根據針對下面的如圖3中示意性示出的四波混頻過程的相位適應條件來確定。

用于CARS顯微術的方法和設備例如從DE 10243449 A1(同時地US 7,092,086 B2)已知，其描述了一種CARS顯微鏡，其具有用于生成可經由顯微鏡光學系統同軸地指向樣本的泵浦光束和斯托克斯光束的部件，并具有用于探測相應的探測光的探測器。

CARS顯微術的進一步的物理原理可以從當前的參考工作收集(參見例如Xie,X.S.等在J.B.Pawley(ed.),Handbook of Biological Confocal Microscopy,3rd edition,New York,Springer,2006中的Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy)。

與傳統的或共焦拉曼顯微術相比，在CARS顯微術中，可以特別地實現更高的探測光產量和對干擾的次生效應的更好抑制。探測光還可以更容易地與輻照光分離。

如所提到的，因為樣本中的分子或者特定化學鍵的特征自然振動可以在CARS顯微術中使用，所以其允許物種選擇成像，其在原理上省掉進一步的標記和染色。利用CARS顯微術，關于樣本的分子結構信息可以以三維空間分辨率獲得。

然而，CARS顯微術總是依賴于樣本中相應的諧振部位的存在。如果諧振部位不存在，或者如果針對感興趣結構，它們的振動狀態的頻率差不足以與周圍區分，則它們不能被探測到。另外，利用CARS顯微術的已知方法，通常難以抑制非諧振背景。

皮秒激光脈沖可以例如用于操作和減少非諧振背景，但是它們需要使用相應復雜的激光器。用于減少非諧振背景的另外的可能性是所謂的“外延探測(epi-detection)”和偏振敏感探測。時間分辨方法也在該情況中使用。另一可能性是控制激勵脈沖的相位。

然而，實踐證明，上述方法是有點繁瑣的。在特定情況下，也期望對樣本中的已定義結構的選擇性強調，但是這在用于CARS顯微術的傳統方法中是不可能的。