[發(fā)明專利]用于增加生物質(zhì)糖化的改良的β-葡萄糖苷酶

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201480062817.X
• 申請(qǐng)日: 2014-09-16
• 公開（公告）號(hào): CN105745322A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫嵐;恩吉姆穆亞翁格·費(fèi)雷爾;迪帕克·辛格;詹妮弗·黑德曼;褚美華;邁克爾·蓋里內(nèi);桑德拉·雅各布森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 易登尼有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12N9/34;C12N15/56;C12N15/81;C12P21/00
• 代理公司: 北京信慧永光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11290
• 代理人: 洪俊梅;張淑珍

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2013年9月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/878,989的優(yōu)先權(quán)，出于所有目的，以引用的方式將其整體并入本文。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素材料包含處于復(fù)雜聚合物形式的碳水化合物。聚合物可以分解為簡(jiǎn)單的糖，轉(zhuǎn)而又可以用于生產(chǎn)包括乙醇在內(nèi)的各種產(chǎn)品。各種生物質(zhì)原料具有木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，其中，木質(zhì)素包圍著半纖維素和纖維素碳水化合物，其釋放在使用纖維素酶進(jìn)行酶處理時(shí)增加。然而，酶的成本和水解的低效率是與木質(zhì)纖維素材料作為可發(fā)酵糖來(lái)源的潛質(zhì)相關(guān)的主要問題。

β-葡萄糖苷酶(BG)是將二糖(纖維二糖)水解為單糖(葡萄糖)的關(guān)鍵纖維素酶。在葡聚糖糖化中的這個(gè)最后步驟產(chǎn)生了用于發(fā)酵的優(yōu)選的糖(葡萄糖)，并有效地清除了其終產(chǎn)物的酶途徑。如果葡萄糖濃度高，發(fā)生上游纖維素酶的終產(chǎn)物抑制。終產(chǎn)物抑制通過降低上游酶的催化活性而降低通過糖化途徑的通量(flux)，所述上游酶包括纖維二糖水解酶(CBH1、CBH2)和內(nèi)切葡聚糖酶(EG)。因此，在葡萄糖滴度(titer)和糖生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)中降低了整體糖化效率。

可獲得的BG酶在通常發(fā)現(xiàn)于生物質(zhì)糖化反應(yīng)中的葡萄糖水平的存在下可具有降低的活性，即產(chǎn)物抑制。降低的活性一般可以量化為在指定的時(shí)間內(nèi)在指定的反應(yīng)條件下、存在葡萄糖與不存在葡萄糖時(shí)發(fā)生的底物水解的量。根據(jù)不同的抑制機(jī)制，產(chǎn)物抑制可能導(dǎo)致改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，例如米氏常數(shù)(Michaelis-Mentenconstant，Km)和最大速度(Vmax)。競(jìng)爭(zhēng)性抑制增加了表觀Km而不影響Vmax的值。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(noncompetitiveinhibition)降低了表觀Vmax而不影響Km。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制(uncompetitiveinhibition)同時(shí)降低了Km和Vmax的表觀值。還存在混合抑制，其對(duì)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)具有更為復(fù)雜的影響。這些BG酶還可具有次佳的半衰期和熱耐受性，使得獲得改良形式的BG以用于在糖化過程中得到最高的葡萄糖產(chǎn)率是有用的。除其它事項(xiàng)外，本公開內(nèi)容提供了改良的β-葡萄糖苷酶，其增加了纖維二糖向葡萄糖的轉(zhuǎn)化，從而改善了糖化效率。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)?zhí)峁┝烁牧嫉摩?葡萄糖苷酶以及使用該改良的β-葡萄糖苷酶來(lái)將纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的方法。本申請(qǐng)還提供了包含編碼本文所述的改良的β-葡萄糖苷酶的核酸的多核苷酸以及包含所述改良的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列的多肽。

因此，在一個(gè)方面，本文提供了改良的β-葡萄糖苷酶，所述改良的β-葡萄糖苷酶包含相對(duì)于參考β-葡萄糖苷酶或未經(jīng)修飾的β-葡萄糖苷酶而言具有增加的β-葡萄糖苷酶活性的多肽。在一些實(shí)施方式中，所述改良的β-葡萄糖苷酶包含與SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10、SEQIDNO：12或SEQIDNO：14的氨基酸序列具有至少70％的序列一致性，并且相對(duì)于包含SEQIDNO：2的氨基酸序列的對(duì)照β-葡萄糖苷酶而言具有改善的β-葡萄糖苷酶活性的多肽。

在一些實(shí)施方式中，所述改良的β-葡萄糖苷酶包含對(duì)應(yīng)于選自于由以下位置所組成的組中的位置的一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸：

(a)SEQIDNO：2的位置66，其中，對(duì)應(yīng)于位置66的氨基酸為除T以外的氨基酸；

(b)SEQIDNO：2的位置70，其中，對(duì)應(yīng)于位置70的氨基酸為除L以外的氨基酸；

(c)SEQIDNO：2的位置136，其中，對(duì)應(yīng)于位置136的氨基酸為除G以外的氨基酸；

(d)SEQIDNO：2的位置139，其中，對(duì)應(yīng)于位置139的氨基酸為除I以外的氨基酸；

(e)SEQIDNO：2的位置167，其中，對(duì)應(yīng)于位置167的氨基酸為除L以外的氨基酸；

(f)SEQIDNO：2的位置250，其中，對(duì)應(yīng)于位置250的氨基酸為除Q以外的氨基酸(野生型氨基酸為Q)；

(g)SEQIDNO：2的位置286，其中，對(duì)應(yīng)于位置286的氨基酸為除A以外的氨基酸；

(h)SEQIDNO：2的位置363，其中，對(duì)應(yīng)于位置363的氨基酸為除Y以外的氨基酸；

(i)SEQIDNO：2的位置375，其中，對(duì)應(yīng)于位置375的氨基酸為除Y以外的氨基酸；

(j)SEQIDNO：2的位置376，其中，對(duì)應(yīng)于位置376的氨基酸為除E以外的氨基酸；