[發明專利]檢測培養細胞中是否存在目標組分的周期性結構的方法

有效

• 申請號: 201480061172.8
• 申請日: 2014-11-05
• 公開（公告）號: CN105705933B
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 邁克爾·普呂默爾
• 申請（專利權）人: 弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
• 主分類號: G01N15/02
• 分類號: G01N15/02;G01N33/50;G06T7/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;楊生平

一種為了周期性結構的存在而檢測培養細胞的方法，所述方法包括以下步驟：?提供培養細胞，?固定培養細胞，?使用第一染色劑對固定的培養細胞染色，?刺激第一染色劑使其發射光，?拍攝固定的培養細胞的二維圖像(2)，?使從固定的培養細胞的圖像(2)導出的第一和第二濾波圖像互相關以獲得相關圖像(3)，以及，?通過確定在相關圖像(3)中是否存在具有亮度最大值和最小值的周期性結構來確定固定的培養細胞中周期性結構的存在或不存在。

技術領域

本發明涉及為了培養細胞中包含的至少一種目標組分(例如一種或多種蛋白)的周期性結構的存在而檢測多個培養細胞的方法。

背景技術

心肌(或骨骼肌)的嚴重疾病的幾個表型與心肌細胞(或肌細胞，分別地) 中的肌節結構的損傷有關。為簡單起見，以下僅提及心肌細胞。在心肌細胞中，肌節是能夠收縮和舒張的最小亞單位。

圖1(舒張狀態)和圖2(收縮狀態)示意性地示出肌節。肌節1以兩個z 盤10為界并還包括兩個相間錯雜的肌絲系統。兩個相間錯雜的肌絲系統的第一肌絲系統的細肌絲由六聚肌動蛋白鏈11組成，這兩個相間錯雜的肌絲系統的第二肌絲系統的粗肌絲由六聚肌球蛋白鏈12組成。肌球蛋白鏈12通過由蛋白質肌聯蛋白組成的兩個彈性元件13連接于兩個z盤10。隨著ATP(三磷酸腺苷) 的水解，肌球蛋白鏈12的馬達蛋白肌球蛋白經歷構象變化，其轉換為移動肌動蛋白鏈11的動力沖程，導致肌節1的收縮(見圖2)。大量這種肌節1發生收縮導致心肌收縮，而相反的過程導致心肌舒張。

已經可以在表現出自發和同步搏動的成熟的培養的活的心肌細胞中觀察到收縮運動，并且活的心肌細胞的這種自發和同步的搏動可用于表征活的心肌細胞的成熟發展狀態。

在固定的心肌細胞中，肌節結構的結構完整性指示了心肌細胞的成熟發展狀態。例如通過添加清潔劑到活的心肌細胞由此活的心肌細胞的細胞膜受損(活的心肌細胞被殺死)以及通過添加甲醛由此包含在心肌細胞中的蛋白質交聯但心肌細胞中的蛋白質的結構維持并保持固定來實施心肌細胞的固定。

為了鑒別針對與肌節結構的損傷相關的心肌的疾病的潛在藥物候選物質，進行體外實驗，其中通過加入如葡萄糖和/或內皮素的物質對活心肌細胞進行應激直到心肌細胞失去其搏動能力而不殺死心肌細胞(模擬心肌癥)。此后，將候選藥物物質添加到所應激的心肌細胞中以檢測藥物候選物質是否具有對心肌細胞的復蘇效應，該復蘇效應導致心肌細胞開始再次搏動。對于此檢測，關于心肌細胞是否已經開始再次搏動，記錄并分析心肌細胞的小影片(只有在分析影片時才可以評估搏動收縮和隨后的舒張周期)。然而，如所概述的，必須通過觀看影片的人進行影片的分析，這消耗時間和資源。此外，觀看和分析影片的人必須具有所需的教育和技能。

可替代地，在已經將藥物候選物質添加到活的心肌細胞中之后，以及在這些已被隨后固定之后，為肌節的周期性結構的存在檢測已固定的心肌。肌節的這種周期性結構指示固定之前心肌細胞已經復蘇。這可以通過拍攝必須由人類通過光學檢測仔細分析的固定的心肌細胞的圖像來實施。這又是很耗費時間和資源的，并且進行光學檢測的人員必須具備必要的教育和技能。即使這樣，圖像非常難以分析。

發明內容

因此，總體來說，本發明的目的是提出為培養細胞中的特定組分的周期性結構的存在而檢測培養細胞的方法。更具體地說，本發明的目的是提出用于鑒別潛在藥物候選物質的方法，該潛在藥物候選物質用于治療與肌節結構的損傷有關的肌肉疾病或心肌疾病。

根據一個方面，本發明提出為了培養細胞中包含的至少一種目標組分的周期性結構的存在而檢測多個培養細胞的方法。該方法包括以下步驟：

-提供待檢測的多個培養細胞，

-固定待檢測的培養細胞同時保持包含在培養細胞中的至少一種目標組分的任何結構，

–使用與所述至少一種目標組分結合并能夠在受刺激時發射具有第一波長的光的第一染色劑，對包含在固定的培養細胞中的所述至少一種目標組分進行染色，