[發(fā)明專利]分離方法、檢測(cè)方法、信號(hào)測(cè)定方法、疾病的判定方法、疾病治療藥的藥效評(píng)價(jià)方法、試劑盒以及液態(tài)組合物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201480060471.X
• 申請(qǐng)日: 2014-11-06
• 公開（公告）號(hào): CN105723221A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 藤井寬也;水內(nèi)素晶;山口哲司;安倍弘喜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: JSR株式會(huì)社;JSR生命科學(xué)株式會(huì)社
• 主分類號(hào): G01N33/544
• 分類號(hào): G01N33/544;G01N33/50;G01N33/53;G01N33/543
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 左嘉勛;顧晉偉

本發(fā)明提供夾雜物的除去效率優(yōu)異且具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡不易被破壞的具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法。上述具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法的特征在于，包含:復(fù)合體形成工序，使含有具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的生物體試樣與鍵合有識(shí)別存在于上述囊泡表面的表面抗原的配體的固相載體進(jìn)行接觸，形成上述囊泡和上述固相載體的復(fù)合體；清洗工序，清洗上述復(fù)合體；在非離子性表面活性劑的存在下進(jìn)行上述復(fù)合體形成工序和上述清洗工序中的至少任一工序。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分離方法、檢測(cè)方法、信號(hào)測(cè)定方法、疾病的判定方法、疾病治療藥的藥效評(píng)價(jià)方法、試劑盒以及液態(tài)組合物。更詳細(xì)而言，涉及外泌體等具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法，利用了該方法的核酸或者蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法、信號(hào)測(cè)定方法、疾病的判定方法、疾病治療藥的藥效評(píng)價(jià)方法、疾病判定或者藥效評(píng)價(jià)用試劑盒以及上述分離方法中使用的液態(tài)組合物。

背景技術(shù)

囊泡具有脂質(zhì)雙層膜所包圍的結(jié)構(gòu)，這樣的囊泡中，作為生物體內(nèi)的體液中存在的囊泡顆粒，已知有外泌體。已知在外泌體的表面，與一般的細(xì)胞表面同樣地存在各種膜蛋白質(zhì)，另一方面，也可知在外泌體的內(nèi)部，除細(xì)胞因子等各種蛋白質(zhì)以外也含有microRNA(miRNA)。

另外，已知從免疫系統(tǒng)的細(xì)胞、各種癌細(xì)胞等各種細(xì)胞分泌外泌體，作為生物體內(nèi)的細(xì)胞間通訊的媒介作用的外泌體的功能，外泌體與生理現(xiàn)象、癌等疾病的相關(guān)性受到關(guān)注，正在開展這些研究。例如，已經(jīng)報(bào)告使用作為腫瘤標(biāo)志物的EpCAM的抗體時(shí)，從卵巢癌患者的循環(huán)血液中分離外泌體，來自外泌體的miRNA表達(dá)量與卵巢癌的進(jìn)展之間具有相關(guān)性(非專利文獻(xiàn)1)。

另外，作為外泌體上表達(dá)的四次跨膜的膜蛋白質(zhì)，有屬于四次跨膜蛋白家族的CD9、CD63以及CD81，非專利文獻(xiàn)2中報(bào)告了黑色素瘤患者的血漿中的外泌體量比健康人高，這能夠用針對(duì)CD63的抗體、針對(duì)腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的Caveolin－1的抗體進(jìn)行檢測(cè)·定量化。另外，對(duì)離心分離后的血漿樣品組合CD63抗體、針對(duì)各種膜蛋白質(zhì)的抗體等進(jìn)行反應(yīng)，由此對(duì)來自癌患者的外泌體的信號(hào)進(jìn)行定量解析(專利文獻(xiàn)1)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開第2010/065968號(hào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1:D.D.Taylor.,et al.,Gynecol.Oncol.,110,13-21(2008)

非專利文獻(xiàn)2:M.Logozzi.,et al.,PLoS ONE.,4,1-10(2009)

發(fā)明內(nèi)容

然而，作為鍵合抗體的固相載體的反應(yīng)液、清洗液、將抗體鍵合粒子懸浮的緩沖液的功能，要求減少對(duì)平板等反應(yīng)容器、粒子表面的非特異性吸附，減少反應(yīng)中發(fā)生的粒子的凝聚的功能。

然而，用磁性粒子這樣的粒子捕捉像上述外泌體那樣的被脂質(zhì)雙層膜覆蓋的囊泡時(shí)，不但容易引起上述非特異性吸附，而且容易產(chǎn)生粒子彼此的凝聚，有時(shí)對(duì)囊泡的回收率、粒子的清洗效率造成負(fù)面影響。如果反應(yīng)后的抗體鍵合粒子的清洗不充分，則存在來自檢體的夾雜蛋白質(zhì)混入，外泌體的精制度降低的問題。

因此，要將被脂質(zhì)雙層膜覆蓋的囊泡分離時(shí)，也需要能夠減少對(duì)固相載體的非特異性吸附和粒子的凝聚、清洗能力高的緩沖液。

然而，發(fā)現(xiàn)即使將一般用于抑制非特異性吸附、粒子凝聚所使用的BSA等蛋白質(zhì)添加到粒子保存緩沖液、反應(yīng)緩沖液等中，要將被脂質(zhì)雙層膜覆蓋的囊泡分離時(shí)，粒子也會(huì)凝聚，進(jìn)而對(duì)其后進(jìn)行的精制外泌體的蛋白質(zhì)組解析等造成影響。

另外，將被脂質(zhì)雙層膜覆蓋的囊泡分離時(shí)，還要求對(duì)具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的破壞少。

本發(fā)明要解決的課題在于提供夾雜物的除去效率優(yōu)異且具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡不易被破壞的具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法。