[發(fā)明專利]從復(fù)雜樣品中分離微生物的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201480059941.0
• 申請日: 2014-10-09
• 公開（公告）號: CN105658806A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: M.霍納德爾;S.茹埃特
• 申請（專利權(quán)）人: 默克專利股份公司
• 主分類號: C12Q1/24
• 分類號: C12Q1/24;C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權(quán)陸軍;萬雪松

本發(fā)明涉及從包含哺乳動物細(xì)胞的樣品中分離以及任選地檢測微生物的方法，所 述方法包括使用包含Benzonase?核酸酶的裂解緩沖液。本發(fā)明還涉及包含Benzonase?核 酸酶的裂解緩沖液及其用途。

微生物負(fù)載監(jiān)測與及時結(jié)果對于重組蛋白或來自生物反應(yīng)器的其它生物技術(shù)產(chǎn) 物的生產(chǎn)期間中的質(zhì)量控制而言至關(guān)重要。

生物反應(yīng)器樣品的生物負(fù)載水平通常由膜過濾和后續(xù)在培養(yǎng)基或貧瘠平板（poor plating）上的溫育確定。由于生物反應(yīng)器樣品的顆粒含量，尤其是當(dāng)生物反應(yīng)器中存在高 水平的哺乳動物細(xì)胞時，僅少量樣品可被過濾（1ml至2ml或甚至更少），這需要多個過濾 步驟以能夠?qū)γ總€樣品的代表性體積進(jìn)行測試。

可以通過添加用于分離哺乳動物細(xì)胞和微生物的差速離心步驟來改進(jìn)此方法。在 這種情況下，將含有微生物的上清液在膜上過濾并在培養(yǎng)基上溫育。此方法的缺點(diǎn)在于一 些可能被哺乳動物細(xì)胞捕獲或粘附的污染物有可能丟失。

出于診斷目的，需要高樣品體積以能夠檢測低水平污染。不盡如人意的膜過濾性 導(dǎo)致開發(fā)出了能夠有差別地裂解臨床樣品的真核細(xì)胞而不裂解所包含的微生物的裂解緩 沖液。在裂解緩沖液處理后，過濾樣品并將膜在培養(yǎng)基上溫育。在一些情況下，分子方法可 用于更快地檢測微生物。在這種情況下，需要在裂解真核細(xì)胞后應(yīng)用特定的處理以移除高 含量的可能干擾檢測方法的真核生物DNA。在后續(xù)步驟中，裂解微生物以釋放其DNA。純化此 DNA并隨后通過分子方法（如PCR或?qū)崟rPCR）檢測。由于許多人工處理步驟，所以全部這些步 驟的組合是耗時而費(fèi)力的。

在現(xiàn)有技術(shù)中，描述了通過選擇性裂解哺乳動物細(xì)胞而分離和檢測哺乳動物細(xì)胞 樣品的微生物污染的解決方案。這些出版物涉及在臨床樣品（如體液，特別是血液）中檢測 微生物污染。

例如，WO2009/015484A1公開了通過選擇性裂解血細(xì)胞同時使用皂苷制劑保護(hù) 微生物細(xì)胞，從血液中分離和檢測微生物和微生物核酸的快速方法。

在WO2011/070507A1中，通過將樣品在堿性條件下于非離子型去垢劑中溫育而 實(shí)現(xiàn)對樣品中血細(xì)胞的選擇性裂解。

US2008/0131955A1描述了從體液樣品中混合的DNA分離靶DNA的方法，其涉及選 擇性裂解哺乳動物細(xì)胞的步驟。

EP0745849A2公開了處理全血以用于樣品中可能存在的微生物的核酸分析的方 法，其中紅細(xì)胞經(jīng)過了選擇性裂解。

然而，具有大體積和高細(xì)胞密度的復(fù)雜生物反應(yīng)器樣品依然給檢測微生物污染造 成了挑戰(zhàn)。因此，本發(fā)明的目的是開發(fā)在包含哺乳動物細(xì)胞的復(fù)雜樣品中分離和/或檢測微 生物污染的方法。

在第一個方面，本發(fā)明涉及從包含哺乳動物細(xì)胞的樣品中分離微生物的方法，其 包括

a)使樣品與包含Benzonase?核酸酶的裂解緩沖液接觸，

b)通過移除哺乳動物細(xì)胞而獲得微生物。

在第二個方面，本發(fā)明涉及從包含哺乳動物細(xì)胞的樣品中分離和檢測微生物的方 法，包括

a)使樣品與包含Benzonase?核酸酶的裂解緩沖液接觸，

b)通過移除哺乳動物細(xì)胞而獲得微生物，

c)對微生物進(jìn)行通用裂解，

d)實(shí)施特定的或通用的檢測方法以檢測微生物。

根據(jù)本發(fā)明的方法提供了若干優(yōu)點(diǎn)：

－快速分析大樣品體積（最多至50ml；在小于20min內(nèi)分離細(xì)菌）、

－以良好的靈敏度在具有大量哺乳動物細(xì)胞（總體最多至5*10⁸個細(xì)胞）的樣品中檢 測微生物、

－簡單而有限的人工操作。

包含哺乳動物細(xì)胞的樣品可以是其中疑似或可能疑似有微生物存在和/或生長的 任何臨床或非臨床樣品，以及那些被定期或偶爾測試微生物存在的材料的樣品。樣品可以 是新鮮的或冷凍的樣品。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品為生物反應(yīng)器樣品。

根據(jù)本發(fā)明可以考慮任何種類的生物反應(yīng)器。

可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法（例如通過將少量細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至容 器中）從生物反應(yīng)器獲得樣品。容器可以是適用于本方法的任何管或反應(yīng)容器。

通常，樣品中哺乳動物細(xì)胞的數(shù)量為至少10⁶個細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品 中哺乳動物細(xì)胞的數(shù)量為至少10⁷個細(xì)胞。