[發(fā)明專利]微生物的檢查方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480056925.6
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN105637101A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 大津貴義;一色淳憲
• 申請（專利權(quán)）人: 東洋制罐集團控股株式會社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/09;G01N1/02
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 蔣亭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微生物的檢查方法，特別涉及用于同時迅速地檢測多種微生物的 檢查方法。

背景技術(shù)

以往，在食品制造現(xiàn)場或臨床現(xiàn)場、以及文物等的保護環(huán)境等中，檢查是否存在有 霉菌等微生物、確認安全性、并且防止其繁殖十分重要。

作為此種以微生物、特別是霉菌作為對象的檢查方法，可以舉出以下所示的3種方 法。

首先，作為第一方法，可以舉出如下的方法，即，從環(huán)境中采集試樣而進行前培養(yǎng) (所采集的菌的同時培養(yǎng))，然后，在對每個菌種最佳的培養(yǎng)基中進行20天左右的培養(yǎng)后，觀 察形態(tài)的特征，由此來鑒定微生物，進行其存在與否的確認(參照專利文獻1)。

另外，作為第二方法，可以舉出如下的方法，即，從環(huán)境中采集試樣而進行前培養(yǎng) 后，對各菌進行單獨培養(yǎng)，從培養(yǎng)細胞中提取DNA，利用PCR(聚合酶鏈式反應)法擴增靶區(qū) 域，分析該區(qū)域的堿基序列，由此進行微生物的鑒定及存在確認。

此外，作為第三方法，可以舉出如下的方法，即，制成包含與靶區(qū)域互補地結(jié)合的 堿基序列的探針并固定化在DNA芯片的基板上，將借助PCR法的擴增產(chǎn)物滴加至DNA芯片，使 靶區(qū)域與探針雜交，進行試樣中所含的微生物的鑒定及存在確認(參照專利文獻2)。

基于形態(tài)進行微生物的鑒定的第一方法需要在進行前培養(yǎng)而生長后單獨地進行 培養(yǎng)。此時為了表達微生物的形態(tài)的特征，需要對每個菌種準備最佳的培養(yǎng)基并進行長時 間的培養(yǎng)，因此根據(jù)微生物種類會需要長達50天左右的檢查期間。另外，在微生物的鑒定時 需要熟練，因此不適于迅速的檢查或簡易的檢查。

在借助序列分析的第二方法中，也需要在前培養(yǎng)后對每個菌種單獨進行培養(yǎng)。因 此，作為檢查期間需要14天左右。另外，由于是對每個菌種單獨進行分析的方法，因此不適 于需要同時檢查多個樣品的情況。

另一方面，在使用DNA芯片的第三方法中，可以不用對每個菌種單獨進行培養(yǎng)地檢 測微生物，能夠?qū)z查期間縮短到9天左右。

然而，迫切期望使檢查進一步加速，也就是在檢查現(xiàn)場，在從環(huán)境中采集試樣的當 天之中即想要知道其結(jié)果。

但是，在使用DNA芯片的第三方法中也需要前培養(yǎng)，該前培養(yǎng)需要7天左右，因此第 三方法無法響應該要求。

此處，提出過能夠不進行前培養(yǎng)地實施使用了DNA芯片的微生物的檢查的、用于微 小有機體的迅速的檢測的方法(參照專利文獻3)。

專利文獻1：日本特開2007-195454號公報

專利文獻2：日本特開2008-35773號公報

專利文獻3：日本特開2007-508811號公報

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明所要解決的問題

然而，該用于微小有機體的迅速檢測的方法是從微生物中提取RNA的方法，在微生 物為孢子形態(tài)的情況下，無法獲得RNA。另一方面，無法選擇性地捕集非孢子形態(tài)的微生物， 因此存在有需要用于使孢子發(fā)芽的恢復工序的問題。

另外，為了能夠不進行RNA或與之互補的DNA的擴增地檢測微生物，需要捕集數(shù)量 非常多的微生物的細胞(實施例中使用百萬個細胞。在比較骯臟的環(huán)境下，取樣需要數(shù) 天。)，存在有難以縮短包括取樣在內(nèi)的整個檢查的期間的問題。

本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，其目的在于，提供一種能夠進一步縮短包括取 樣在內(nèi)的整個檢查的期間的微生物的檢查方法。

用于解決問題的方法

為了達成上述目的，本發(fā)明的微生物的檢查方法是同時判定環(huán)境中是否存在多種 微生物的微生物的檢查方法，具有：采集工序，將飄浮于空氣中的微生物回收到液體中；核 酸提取工序，從液體中的微生物中提取核酸；核酸擴增工序，將所提取的核酸的一部分擴 增；和檢測工序，將含有經(jīng)過擴增的核酸的溶液滴加到預先固定化有多種微生物的核酸的 載體中，在與經(jīng)過擴增的核酸互補地結(jié)合的核酸被固定化在載體上的情況下，鑒定微生物 的種類，在采集工序之后、且核酸提取工序之前，不進行微生物的培養(yǎng)。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠進一步縮短包括取樣在內(nèi)的整個檢查的期間的微生物 的檢查方法。

附圖說明

圖1是表示實施例的空氣采樣器所回收的空氣量與霉菌數(shù)的關(guān)系的圖表。

圖2是表示實施例中使用的引物的堿基序列的圖表。