[發明專利]用于博德特氏菌屬物種的工業規模培養的化學成分確定的培養基

有效

• 申請號: 201480050169.6
• 申請日: 2014-09-11
• 公開（公告）號: CN105518122B
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發明（設計）人: P.M.H.德霍泰;P.戈芬;F.布蘭科多斯桑托斯;B.托伊辛克
• 申請（專利權）人: 葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李唐;黃希貴

用于博德特氏菌屬物種的工業規模培養的化學成分確定的培養基。

背景

博德特氏菌屬(Bordetella)是許多細菌性疾病的致病因子，例如百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）（也稱為百日咳嗜血桿菌（Haemophilus pertussis））導致百日咳，一種可以在嬰幼兒中嚴重的呼吸系統疾病。該疾病的臨床過程的特征在于陣發性快速咳嗽隨后是吸氣費力，經常伴隨特征性“咳咳”的聲音。在嚴重的情況下，缺氧可導致腦損傷；然而最常見的并發癥是繼發性肺炎。

百日咳通常被認為是由百日咳博德特氏菌引起的，但偶爾從具有典型的百日咳表征和癥狀的患者中分離出副百日咳博德特氏菌（B. parapertussis）。副百日咳博德特氏菌感染比百日咳博德特氏菌較不常見，其中5-10%的百日咳與副百日咳博德特氏菌相關（Mertsola (1985) Eur J Clin Microbiol 4; 123; Lautrop (1971) Lancet 1(7711)1195-1198）。副百日咳博德特氏菌伴隨輕微的臨床癥狀，所述臨床癥狀加上副百日咳博德特氏菌與百日咳博德特氏菌的血清學交叉反應性，使得副百日咳博德特氏菌難以診斷。

針對百日咳博德特氏菌的第一代疫苗是全細胞疫苗，由完整的殺死的細菌構成。這些在許多國家中在20世紀50年代和60年代引進并成功減少百日咳的發病率。全細胞百日咳博德特氏菌疫苗的一個問題是與之相關的高水平的反應原性。包含純化的百日咳博德特氏菌蛋白的無細胞疫苗具有較少的反應原性并已經改造用于很多國家的免疫接種計劃。通常包含百日咳毒素（PT）、絲狀血細胞凝集素（FHA）以及非常經常的百日咳桿菌粘附素（PRN）的無細胞疫苗，被廣泛使用，并提供有效保護免于百日咳的嚴重程度。

在這些疫苗中使用的博德特氏菌毒素通過發酵博德特氏菌并分離產生的毒力因子而生成，但是博德特氏菌屬物種是需復雜營養的(fastidious)生物，其難以在高濃度下生長（Doern Clin.infect.dis. 2000, 30 166-173），此外，其難以高水平表達博德特氏菌毒力因子，諸如FHA（絲狀血細胞凝集素）、百日咳桿菌粘附素（PRN）和來自百日咳博德特氏菌的百日咳毒素（PT）。

博德特氏菌在化學成分確定的培養基中生長。例如，Stainer和Scholte (Journalof General Microbiology (1971), 63, 211-220) 公開了用于生產百日咳菌(pertussis)的簡單的化學成分確定的培養基。在化學成分確定的培養基中生長提供優勢，因為不確定的培養基可以在其營養含量中變化導致生長和表達的不可預測性。

但是化學成分確定的培養基可以是昂貴的并且難以制造大量，此外難以設計支持高水平的毒素生產的平衡的化學確定的培養基。本發明人已驚奇地發現，可以對用于百日咳博德特氏菌物種的化學成分確定的培養基進行很多修飾以形成支持高水平的毒力因子生產的簡單的培養基。

發明簡述

在本發明的第一方面，提供了用于博德特氏菌屬物種的化學成分確定的培養基，其中所述化學成分確定的培養基包含一種或多種下列修飾：

（i）所述化學成分確定的培養基包含少于0.035mM、少于0.030mM、少于0.020mM或少于0.010mM硫酸鹽；

（ii）所述化學成分確定的培養基包含選自半胱氨酸和胱氨酸的半胱氨酸來源，其中所述半胱氨酸來源濃度少于0.50mM、少于0.30mM、少于0.25mM、少于0.20mM、少于0.15mM、少于0.10mM、少于0.05mM或少于0.03mM；

（iii）所述化學成分確定的培養基包含選自硫代硫酸鹽、連三硫酸鹽、連四硫酸鹽、過氧二硫酸鹽、硫化物和亞硫酸鹽的無機硫源；