[發明專利]O-甘露糖基轉移酶缺陷的絲狀真菌細胞及其使用方法

在審

• 申請號: 201480048205.5
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN105492457A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: J·納蒂南;J·伊爾塔南;A·雨斯科南;M·薩洛埃莫;C·奧斯特梅爾;B·P·索默;R·瓦爾
• 申請（專利權）人: 諾華股份有限公司;格利科斯芬蘭公司
• 主分類號: C07K14/37
• 分類號: C07K14/37;C07K16/00
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏

1.PMT缺陷的絲狀真菌細胞，包含：

a)第一突變，其與不具有所述第一突變的親本絲狀真菌細胞相比降低或消除內源蛋白 酶活性，和

b)在PMT基因中的第二突變，其與不具有所述第二突變的親本絲狀真菌細胞相比降低 內源O-甘露糖基轉移酶活性，

其中所述絲狀真菌細胞選自木霉屬、鏈孢霉屬、毀絲霉屬和金孢霉屬細胞。

2.權利要求1所述的PMT缺陷的絲狀真菌細胞，其中所述降低內源O-甘露糖基轉移酶活 性的第二突變是編碼內源蛋白O-甘露糖基轉移酶活性的PMT基因的缺失或破壞。

3.權利要求1或2所述的PMT缺陷的絲狀真菌細胞，其中所述PMT基因中的第二突變是在 以下中的突變：

a)包含SEQIDNO：1的多核苷酸的PMT1基因，

b)PMT1基因的功能性同源基因，所述功能性同源基因在引入具有所述PMT1基因中的破 壞的里氏木霉菌株時能夠通過功能性互補恢復親本的O-甘露糖基化水平，或

c)編碼與SEQIDNO：2具有至少50％同一性的多肽的多核苷酸，所述多肽具有O-甘露 糖基轉移酶活性。

4.權利要求1-3任一項所述的PMT缺陷的絲狀真菌細胞，其中所述細胞具有第三突變， 其與不具有所述第三突變的親本細胞中的表達水平相比降低或消除ALG3基因的表達水平。

5.權利要求4所述的PMT缺陷的絲狀真菌細胞，進一步包含編碼N-乙酰葡糖胺基轉移酶 I催化結構域的第一多核苷酸和編碼N-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域的第二多核苷 酸。

6.權利要求1-5任一項所述的PMT缺陷的絲狀真菌細胞，進一步包含一個或多個編碼選 自以下的多肽的多核苷酸：

a)α1,2甘露糖苷酶；

b)N-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域；

c)α甘露糖苷酶II；

d)N-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域；

e)β1,4半乳糖基轉移酶；和

f)巖藻糖基轉移酶。

7.權利要求1-6任一項所述的PMT缺陷的絲狀真菌細胞，其中所述細胞是包含降低或消 除木霉屬pmt1的蛋白O-甘露糖基轉移酶活性的木霉屬細胞。

8.權利要求1-7任一項所述的PMT缺陷的絲狀真菌細胞，其中所述細胞是木霉屬細胞， 例如里氏木霉，且所述細胞包含降低或消除以下活性的突變：

a)三種內源蛋白酶pep1、tsp1和slp1，

b)三種內源蛋白酶gap1、slp1和pep1，

c)選自以下的三種內源蛋白酶：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8,、pepl1、pepl2、 tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2，

d)選自以下的三至六種蛋白酶：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、tsp1、slp1、slp2、slp3、 gap1和gap2，或

e)選自以下的七至十種蛋白酶：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep7、pep8、tsp1、slp1、 slp2、slp3、slp5、slp6、slp7、slp8、tpp1、gap1和gap2。

9.用于生產具有降低的O-甘露糖基化的蛋白質的方法，包括：

a)提供PMT缺陷的絲狀真菌細胞，其在PMT基因中具有突變并進一步包含編碼具有絲氨 酸或蘇氨酸殘基的蛋白的多核苷酸，所述突變與不具有所述突變的親本菌株相比降低內源 O-甘露糖基轉移酶的活性，

b)培養所述PMT缺陷的絲狀真菌細胞以生產所述具有降低的O-甘露糖基化的蛋白，

其中所述絲狀真菌細胞選自木霉屬、鏈孢霉屬、毀絲霉屬或金孢霉屬細胞。