[發明專利]用于對有絲分裂后細胞的疾病和障礙進行靶向和建模的系統、方法和組合物的遞送、工程化和優化

在審

• 申請號: 201480045708.7
• 申請日: 2014-06-11
• 公開（公告）號: CN105683379A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 張鋒;M·海登里希;L·斯維奇
• 申請（專利權）人: 布羅德研究所有限公司;麻省理工學院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/10;C12N9/22
• 代理公司: 北京華睿卓成知識產權代理事務所(普通合伙) 11436
• 代理人: 程淼

1.一種通過操縱感興趣的基因組座位中的有絲分裂后細胞靶序列來修飾生物或非人 類生物從而引起該細胞中的表型改變的方法，該方法包括

遞送非天然存在的或工程化的組合物，該組合物包含：

(A)-I.CRISPR-Cas系統RNA多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列包含：

(a)指導序列，該指導序列能夠雜交到真核細胞中的有絲分裂后細胞靶序列上，

(b)tracr配對序列，和

(c)tracr序列，以及

II.編碼CRISPR酶的多核苷酸序列，該CRISPR酶任選地包含至少一個或多個核定位序 列，

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中在轉錄時，該tracr配對序列雜交到該tracr序列上，并且該指導序列引導CRISPR 復合物與該有絲分裂后細胞靶序列的序列特異性結合，并且

其中該CRISPR復合物包含與(1)雜交到該有絲分裂后細胞靶序列上的該指導序列、和 (2)雜交到該tracr序列上的該tracr配對序列復合的CRISPR酶，并且編碼CRISPR酶的多核 苷酸序列是DNA或RNA，

其中編碼該CRISPR酶的多核苷酸序列可操作地連接至該CRISPR酶的表達的一個或多 個調節序列，借此在該CRISPR酶的表達的情況下在該有絲分裂后細胞中存在該CRISPR復合 物的組裝，以及其操縱。

2.如權利要求1所述的方法，其中編碼CRISPR酶的多核苷酸序列、指導序列、tracr配對 序列或tracr序列的任一者或全部可以是RNA。

3.如權利要求1或2所述的方法，其中對該編碼CRISPR酶的序列、該指導序列、tracr配 對序列或tracr序列進行編碼的多核苷酸可以是RNA并且可以經由脂質體、納米粒子、外泌 體、微囊泡、或基因槍進行遞送。

4.如權利要求1到3中任一項所述的方法，其中這些多核苷酸被包含在含有一種或多種 載體的載體系統中。

5.一種通過操縱感興趣的基因組座位中的有絲分裂后細胞靶序列來修飾生物或非人 類生物的方法，該方法包括

遞送包含病毒載體系統的非天然存在的或工程化的組合物，該病毒載體系統包含一種 或多種病毒載體，該一種或多種病毒載體可操作地編碼用于其表達的組合物，其中該非天 然存在的或工程化的組合物包括：

非天然存在的或工程化的組合物，該組合物包含載體系統，該載體系統包含一種或多 種載體，該一種或多種載體包含

I.第一調節元件，該第一調節元件可操作地連接到CRISPR-Cas系統RNA多核苷酸序列 上，其中該多核苷酸序列包含

(A)指導序列，該指導序列能夠雜交到真核細胞中的腎臟靶序列上，

(b)tracr配對序列，和

(c)tracr序列，以及

II.第二調節元件，該第二調節元件可操作地連接到編碼CRISPR酶的酶編碼序列上，該 CRISPR酶任選地包含至少一個或多個核定位序列，

其中(A)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中組分I和II位于該系統的相同或不同載體上，

其中在轉錄時，該tracr配對序列雜交到該tracr序列上，并且該指導序列引導CRISPR 復合物與該腎臟靶序列的序列特異性結合，并且

其中該CRISPR復合物包含與(1)雜交到該腎臟靶序列上的該指導序列、和(2)雜交到該 tracr序列上的該tracr配對序列復合的CRISPR酶。

6.如權利要求5所述的方法，其中這些病毒載體的一種或多種可以經由脂質體、納米粒 子、外泌體、微囊泡、或基因槍進行遞送。