[發明專利]收集和擴增循環核酸的方法和裝置

在審

• 申請號: 201480042256.7
• 申請日: 2014-07-24
• 公開（公告）號: CN105392900A
• 公開（公告）日: 2016-03-09
• 發明（設計）人: E.L.克瓦姆;J.R.奈爾遜;G.A.格羅斯曼;R.C.赫勒;E.J.芬霍特;C.M.普萊奧;W.P.沃特斯
• 申請（專利權）人: 通用電氣公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;B01D11/04;C12N15/10
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;李炳愛

背景

本申請總體上涉及從生物學樣本收集和擴增循環核酸(CNA)。更特別地，本申請涉及從生物學樣本分離、收集、擴增和進一步檢測循環核酸。

循環核酸從各種組織釋放并在體液中積聚。各種完整和/或碎片的核酸已在CNA中鑒定，包括mRNA、miRNA、線粒體DNA、基因組DNA和反轉錄轉座子。CNA理想地適合于疾病的早期檢測以及預測和治療診斷的應用。CNA的診斷潛力已在廣泛的疾病譜，包括腫瘤發生、炎癥、心肌梗死、自身免疫性疾病和妊娠相關并發癥中得到證實。

循環核酸可使用采集體液樣品的最小侵入方法檢測。然而，CNA以極低豐度存在于體液中。因此，CNA的分析一般往往需要收集和處理大體積(毫升或升)的體液。然而，很多時候，只有非常少量的體液樣本(微升)可供用來分析，特別是在體外診斷、病理學和法醫學領域。此外，大體積的樣本收集往往導致顯著的裝置成本、運輸/處理成本和樣本矯作物(artifact)。另外，因為CNA在體液中存在于細胞外，這種循環的核酸池可逐漸被通過體液中的定居細胞溶解釋放的細胞內DNA或RNA淹沒。這種淹沒或污染可能是時間、溫度、用于穩定的處理類型和用來分離體液的分離力的多參數函數。這些預分析變量可以從存在于體液中的定居細胞產生不希望的基因組污染。例如，在全血樣本中，DNA或RNA可以在貯存和處理期間從血細胞釋放到血漿或血清中。這可干擾存在于血漿或血清中的細胞外循環核酸的分析。循環核酸池的基因組污染可通過維持血樣于4℃和在2小時內處理樣本而減少。然而，這樣的條件對于許多應用往往是不可行的和/或沒有成本效益的。

全基因組擴增可用于擴大循環核酸的天然池。然而，先前使用多重置換擴增(MDA)技術的CNA全基因組擴增的嘗試已強調與體液中CNA的劣質和低量有關的獨特挑戰。一般來說，CNA由于其本質上源自凋亡/壞死細胞，因而是高度片段化的。CNA的核酸片段化模式對于常規的全基因組擴增不是理想的，因而導致等位基因遺失和/或序列偏倚的擴增模式。另外，許多常規的全基因組擴增技術需要納克量的輸入核酸。因此，CNA必須從大體積的非-細胞部分提純，以滿足這些模板濃度要求。鑒于上述，存在對從生物學樣本簡化分離、收集、穩定和/或擴增循環核酸的技術的迫切需求，特別是當分析含有皮克量的CNA的小樣本體積時。

發明簡述

本發明涉及從生物學樣本收集CNA和隨后擴增CNA。

本發明的一個方面涉及一種存在于生物學樣本的非-細胞部分中的循環核酸的擴增方法。該方法包括過濾生物學樣本以將非-細胞部分與完整細胞分離，將分離的非-細胞部分收集到干燥的固體基質上，和從收集的非-細胞部分提取CNA的步驟。該方法還包括環化提取的CNA以形成單鏈核酸環，和通過隨機-引物滾環擴增來擴增單鏈核酸環以形成擴增的CNA產物的步驟。如果CNA以雙鏈形式存在，該方法還包括在用于制備單鏈核酸環的分子內連接反應之前將雙鏈CNA變性為單鏈形式的步驟。線性單鏈CNA的環化可通過能夠分子內連接單鏈核酸的連接酶實現。

本發明的另一方面涉及一種在收集點處理全血以收集含有循環核酸的血漿或血清的方法。該方法包括在收集點過濾全血以從全血分離血漿或血清，將分離的血漿或血清收集到干燥的固體基質上并在固體基質上干燥收集的血漿的步驟。固體基質沒有任何去垢劑。

本發明的另一方面涉及一種從干燥的血漿或血清樣本檢測CNA的方法。該方法包括從干燥的血漿或血清提取CNA，進行提取的循環核酸的全基因組擴增以形成擴增的循環核酸(CNA)產物，和在擴增的CNA產物中檢測特定循環核酸序列的步驟。全基因組擴增通過首先使用能夠分子內連接單鏈核酸的連接酶環化提取的CNA以形成單鏈核酸環，和通過使用隨機引物滾環擴增來擴增單鏈核酸環進行。如果CNA以雙鏈形式存在，該方法還包括在分子內連接反應之前，將雙鏈CNA變性為其單鏈形式的步驟。

本發明的另一方面涉及一種用于收集生物學樣本的包含循環核酸的非-細胞部分的裝置。該裝置包括被配置以將生物學樣本的非-細胞部分與完整細胞分離的過濾膜，和被配置以收集分離的非-細胞部分的干燥的固體基質。過濾膜和固體基質被配制以在它們之間建立直接的接觸。此外，固體基質沒有任何去垢劑。

附圖

所述發明的這些和其它特征、方面和優勢，當參照附圖(其中貫穿整個附圖的相同字符代表相同的部分)閱讀以下詳細描述時，將變得更易理解，其中：

圖1描繪說明本發明方法的實施方案的流程圖。