[發明專利]體細胞基于小分子轉化為神經嵴細胞

有效

• 申請號: 201480041377.X
• 申請日: 2014-07-18
• 公開（公告）號: CN105392881B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: M·格拉夫;R·亞科內;E·C·托馬
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 胡志君;黃革生

本申請涉及一種基于化學確定成分的培養基誘導的關聯步驟，將體細胞分化成多能神經嵴細胞的方法。神經嵴細胞能夠分化成眾多細胞類型，如施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞。

發明領域

本申請涉及一種基于化學確定成分培養基誘導的關聯步驟，將體細胞分化成多能神經嵴細胞的方法。神經嵴細胞能夠分化成眾多細胞類型如施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞。

背景

通過異位表達4種關鍵的發育基因c-myc、Sox2、Oct4和Klf4，使體細胞再編程成經誘導的多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells)的贏得諾貝爾獎的方法是獲得能夠分化成任何細胞類型的患者特異性多潛能細胞的有力工具(Takahashi和Yamanaka，2006)。最近，不同研究已經報告，細胞類型特異性基因還可以直接將一個體細胞類型轉化成另一個體細胞類型，這是一種作為細胞轉化或轉分化報道的方法(Vierbuchen和Wernig，2011)。這種方法代表一種獲得多種確定的細胞用于臨床和研究的有前景策略，從而避免潛在致腫瘤的多潛能階段。

已知的細胞轉化或再編程策略的重大缺陷是要求引入異位基因，所述異位基因可能對已轉化細胞的稍后應用產生不利的影響。為了允許長期和穩定表達，異位基因經常不得不穩定整合入基因組中。盡管可能緊密控制異位基因表達，但整合的基因可以具有不利的影響。例如，引入原癌基因c-myc增加嵌合動物中腫瘤形成的風險，原因在于c-myc再活化(Okita等人,2007)。通常，基因組的復雜調節裝置導致很難預測基因修飾的長期效果。

為了避免再編程方案中基因整合的缺點，新方法通過小分子更換關鍵再編程基因。Li等人通過將某些基因更換為調節特定信號傳導途徑的小分子如Wnt或TGF-β，產生IPS細胞(Li等人,2012)。通過基于小分子抑制BMP、TGFβ和GSK3b信號傳導，基因介導的成纖維細胞轉化成神經元的產率和效率大大增加(Ladewig等人,2012)。與這些結果相符，也已經證明小分子是指導干細胞分化的有價值工具。例如，對骨形態發生蛋白(BMP)和TGF-β信號傳導的抑制導致高度有效的干細胞的神經誘導(Chambers等人,2009)。

并沒有徹底理解小分子影響細胞命運決策的機理。盡管小分子可能足以誘導分化，但是誘導細胞轉化成多能性或另一個體細胞類型仍然需要異位基因表達。這可能歸因于以下事實：與干細胞分化成體細胞相比，改變終末分化細胞的表型成為不同的細胞類型是一種非生理學過程。

本文中提供將體細胞轉化成多能神經嵴細胞的新方法，所述新方法完全基于小分子處理和確定的培養條件并且不需要通過引入基因來遺傳地修飾細胞。

這種新方法利用將體細胞轉分化成增殖性神經嵴樣階段的新型多激酶抑制物。神經嵴細胞可以分化成多種細胞類型如施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞。

例如，可以通過將特定培養基組合以基于小分子抑制確定的信號傳導途徑，誘導神經嵴細胞分化成施旺細胞。神經成熟的施旺細胞代表外周神經系統(PNS)的膠質細胞。施旺細胞執行多種功能，如神經元的免疫保護、養分供應和髓鞘化。施旺細胞功能障礙是外周神經系統的許多神經學病癥(例如多發性硬化或髓鞘化疾病)的原因。

重要地，這種新的細胞轉化方法不需要表達任何異位基因，而僅基于化學處理。因此，它代表有一種產生患者特異性神經嵴細胞或分化細胞如施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞的有前景方法。

發明概述

本文中提供一種從體細胞產生神經嵴細胞的方法，所述方法包括：

a)在補充有丙戊酸(valproic acid)的培養基中培養體細胞，