[發明專利]用于抑制血栓形成的組合物和方法

無效

• 申請號: 201480037652.0
• 申請日: 2014-07-01
• 公開（公告）號: CN105579466A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 陳婉;江思祥;曼朱納坦·拉馬錢德拉·基尼
• 申請（專利權）人: 新加坡國立大學
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C07K14/81;A61K38/17;A61P7/02
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 彭鯤鵬;鄭斌

相關申請

本申請要求于2013年7月1日提交的美國臨時申請No.61/841,642 的權益。

上述申請的全部教導均通過引用并入本文。

背景技術

凝血(也稱為血栓形成(thrombogenesis))是一個重要的生理過程， 其在受傷和組織損傷事件中防止血液從身體過量損失。凝血過程在很大程 度上通過血漿中存在的不同蛋白質進行協調，特別是伴隨酶促反應的復雜 級聯(稱為凝血級聯)的那些。盡管凝塊(血栓)的生理形成對止血和保 持血容量至關重要，但是異常和致病性血栓形成與多種心血管疾病有關 [Peter，K.和G.Y.Lip，ThrombHaemost，2010.103(5)：875-6]。

凝血級聯是調節血栓形成的關鍵過程并且可分為三條途徑：內源性途 徑、外源性途徑和共同途徑[Johari，V.和C.Loke，DisMon，2012. 58(8)：421-3]。參與外源性途徑和共同途徑的蛋白酶(例如因子X(Factor X，FX)、凝血酶和組織因子)是抗血栓形成設計的流行藥物靶標，因為 抑制這些蛋白質的功能可容易地在血液的凝塊形成中實現高抑制效力 [Danalev，D.，MiniRevMedChem，2012.12(8)：第721-30頁]。然而，當 用于抗血栓形成目的時，目前靶向這些靶標的經批準藥物均與過度出血的 高風險相關。

因此，需要經改善的抗凝血組合物和方法以使最常見和嚴重的副作用 過度出血最小化，在市場上見到的很多現有抗凝血劑中均可觀察到過度出 血。

發明內容

如本文中所述的，對金環蛇(Bungarusfasciatus)毒液進行分級并 檢測其對人血漿的凝血酶原時間(prothrombintime，PT)和活化的部分 凝血活酶時間(activatedpartialthromboplastintime，aPTT)的作用。 將延長aPTT但使PT不受影響的級分通過質譜法、蛋白質測序和圓二色 譜學進行進一步分析，并根據針對不同凝血酶的特異性進行篩選。將分離 的候選肽通過一系列功能性測定進行進一步表征，所述測定包括抑制動力 學、western印跡、表面等離子體共振和凝血測定。

純化對FXIa表現出高度特異性抑制的kunitz型蛋白酶抑制劑(稱 為BF01或Fasxiator)。將該蛋白質在大腸桿菌(Escherichiacoli)系統 中重組表達并通過Ni-NTA珠進行純化。BF01的重組形式(rBF01)延長 aPTT，并且證明其以劑量和時間依賴性方式與FXIa相互作用并抑制 FXIa，而并未觀察到對凝血途徑中其他蛋白酶(激肽釋放酶、FXIIa、FXIa、 FXa、FIXa、FVIIa、尿激酶、α-凝血酶)的抑制。使用western印跡通 過探測FIX和FIXa觀察到rBF01對FXIa切割FIX具有抑制作用。還 進行了rBF01的誘變分析，其產生具有高得多效力的突變體(例如，約 100至1000倍，具有一個或更多個殘基替換)。

因此，BF01是一種高度特異性的抗凝血蛋白，其靶向內源性途徑中 的FXIa，但卻不接觸凝血級聯的外源性途徑和共同途徑。因此，BF01代 表一種新的具有最小出血副作用的抗凝血劑，所述出血副作用與當前批準 的很多抗凝血劑相關。

因此，在一個方面，本發明涉及(一種或更多種)分離的肽，其包含 BF01肽、BF01肽的變體和/或BF01肽的突變體。

在另一個方面，本發明涉及在有此需要的個體中抑制血栓形成的方 法，其包括施用有效量的(一種或更多種)BF01肽、其一種或更多種變 體和/或其一種或更多種突變體的全部或生物活性部分。

在另一個方面，本發明涉及在有此需要的個體中選擇性地抑制內源性 凝血途徑的方法，其包括施用有效量的(一種或更多種)BF01肽、其一 種或更多種變體和/或其一種或更多種突變體的全部或生物活性部分。

在又一個方面，本發明涉及在有此需要的個體中選擇性地抑制FX1 的方法，其包括施用有效量的(一種或更多種)BF01肽、其一種或更多 種變體和/或其一種或更多種突變體的全部或生物活性部分。

附圖簡述

圖1A至1B：檢查組分的分子量低于8KD的合并HPLC級分對活 化的部分凝血活酶時間(aPTT)(圖1A)和凝血酶原時間(PT)(圖1B) 的延長。