[發明專利]來自秋葉氏芽孢桿菌的密碼子改性淀粉酶

有效

• 申請號: 201480035615.6
• 申請日: 2014-06-17
• 公開（公告）號: CN105339493B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: J·T·安諾生;N·班克
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N9/28
• 分類號: C12N9/28
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

本發明涉及使用用于表達來自秋葉氏芽孢桿菌成熟淀粉酶AX856的密碼子改性多核苷酸構建體，對該淀粉酶進行編碼的一種分離的合成多核苷酸。

對序列表的引用

本申請包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用結合在此。

發明領域

本發明涉及編碼成熟淀粉酶的分離的合成多核苷酸、包括該多核苷酸的多核苷酸構建體、用所述多核苷酸或多核苷酸構建體轉化的或包括所述多核苷酸或多核苷酸構建體的重組宿主細胞，以及用于生產成熟淀粉酶的方法，所述方法包括如在有助于表達該淀粉酶的條件下培養宿主細胞的步驟。

發明背景

在酶的高度競爭性工業制造中，不斷地改進產率或產量是至關重要的。出于此目的，已經將基因操作或基因工程化投入使用多年，其中已經將編碼感興趣的多肽的基因置于異源的或合成的啟動子的轉錄控制下，已經在不同宿主細胞中用異源信號肽表達它們，并且已經以多個拷貝將它們整合進宿主細胞基因組中，以便達到所謂的mRNA飽和。

已經基于旨在其表達的宿主細胞的情況，并且基于不同理論mRNA熔點或三級結構計算，將用來增加酶產量的另一熟知技術用于優化酶編碼DNA序列中的密碼子使用。

雖然如此，仍對鑒別新方式以便改進感興趣的酶的表達具有顯著的興趣。由于酶制造業中高度競爭性的環境，即使微小的改進也是希望的。

發明概述

我們構建了地衣芽孢桿菌親本宿主菌株，用于編碼與來自AmyL淀粉酶的異源信號肽融合的、感興趣的成熟淀粉酶多肽的多核苷酸的三個相同的拷貝的位點特異性整合。

然后通過將天然秋葉氏芽孢桿菌(Bacillus akibai)AX856成熟淀粉酶編碼基因(SEQ ID NO:1)的三個相同拷貝連同AX856淀粉酶編碼基因的三個不同的合成密碼子優化版本(分別是Syn1(SEQ ID NO:2)、Syn2(SEQ ID NO:3)和Syn3(SEQ ID NO:4))引入親本菌株，構建四種子代菌株。令我們驚訝的是，合成基因之一，Syn3(SEQ ID NO:4)，表現極大地優于另兩種合成基因幾乎兩倍的一個因子。

相應地，在一個第一方面，本發明提供了編碼成熟淀粉酶的分離的合成多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:4中示出的核苷酸序列。

在一個第二方面，本發明涉及一種核酸構建體，該核酸構建體包括如在第一方面中限定的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至提供該多核苷酸在所選擇的宿主細胞中的表達的控制序列。

在一個第三方面，本發明涉及用如在第一方面中限定的多核苷酸或如在第二方面中限定的多核苷酸構建體轉化的或包括該多核苷酸或該多核苷酸構建體的一種重組宿主細胞，其中所述宿主細胞生產該成熟淀粉酶。

在最后一個方面，本發明涉及用于生產成熟淀粉酶的方法，所述方法包括以下步驟：

a)在有助于表達該淀粉酶的條件下培養如在第三方面中限定的宿主細胞；以及任選地

b)回收淀粉酶。

定義

編碼序列：術語“編碼序列”是指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由一個開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始并且以一個終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是一種基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。