[發(fā)明專利]用于產(chǎn)生唾液酸化聚糖之具有轉(zhuǎn)唾液酸酶活性的突變體唾液酸酶

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201480030151.X
• 申請(qǐng)日: 2014-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN105246911B
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 約恩·達(dá)爾埃格德·米克爾森;卡斯滕·耶爾斯;馬爾維納·米夏拉克;卡斯珀·普拉內(nèi)塔·凱普;多特·默勒·拉森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 丹麥科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C12N9/24
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 鄭斌;彭鯤鵬

本發(fā)明提供了具有轉(zhuǎn)唾液酸酶活性的突變體酶(EC 3.2.1.18)，其特征在于與其親本唾液酸酶相比具有增加的轉(zhuǎn)唾液酸酶∶唾液酸酶比。另外所述酶可用于使單糖和寡糖轉(zhuǎn)唾液酸化的方法，所述寡糖包括半乳寡糖(GOS)、果寡糖(FOS)、麥芽寡糖(MOS)、異麥芽寡糖(IMO)、乳果糖、蜜二糖、麥芽糖、糖基蔗糖、乳果寡糖和巖藻糖。用該突變體酶產(chǎn)生的轉(zhuǎn)唾液酸化的單糖和寡糖可用于制備嬰兒配方食品、益生元營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和食品補(bǔ)充劑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有轉(zhuǎn)唾液酸酶(trans-sialidase)活性的酶(EC3.2.1.18)，其通過(guò)突變衍生自錐蟲(Trypanosomal)唾液酸酶。通過(guò)突變獲得的酶特別可用于產(chǎn)生多樣的唾液酸化的半乳寡糖(galacto-oligosaccharide，GOS)和果寡糖(fructo-oligosaccharideFOS)，這些是嬰兒配方食品(infantformula)、益生元營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和食品補(bǔ)充劑中的重要添加劑。

背景技術(shù)

益生元是促進(jìn)結(jié)腸中選定組的微生物之生長(zhǎng)的膳食物質(zhì)并且另外可具有其他健康益處。半乳寡糖(GOS)、果寡糖(FOS)、乳果糖(lactulose)和異麥芽寡糖(isomaltooligosaccharide，IMO)是少數(shù)經(jīng)充分確定的益生元。在人乳中，寡糖構(gòu)成第三大組分，在圍產(chǎn)期以高達(dá)20g/l至25g/l的量存在，隨后下降至5g/L至15g/L。除少數(shù)例外，所有已知的人乳寡糖(HMO)具有乳糖核心并通過(guò)與一個(gè)或更多個(gè)半乳糖和N-乙酰葡糖胺單元連接而延長(zhǎng)，并且可用幾個(gè)唾液酸和巖藻糖殘基進(jìn)行修飾。已經(jīng)鑒定了超過(guò)100種不同的這類聚糖結(jié)構(gòu)，這些中約10％至20％被唾液酸化(Bode，2012，Glycobiology 22(9)：1147-1162)。許多這些HMO的唾液酸化和/或巖藻糖基化似乎傳達(dá)重要的功能特性。例如，HMO可與人病原體結(jié)合，例如，大腸桿菌K1(Escherichia coli K1)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)和無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)，從而降低嬰兒中腹瀉和其他疾病的發(fā)病率。HMO作為人病原體的可溶性誘餌受體起作用的這種能力很可能通過(guò)其多樣性而增強(qiáng)，因?yàn)楹事短堑奶堑鞍住⑼僖核峄木厶呛蛶r藻糖基化的聚糖各自靶向病原體的不同亞群(Kunz等，2000 Ann.Rev.Nutrition 20：699-722)。此外，唾液酸化的HMO可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)；例如T細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生受到體外唾液酸化的HMO的刺激(Eiwegger等，2004，Pediatric Rev.56：536-540)。在大多數(shù)情況下，尚未鑒定活性的HMO分子，但在壞死性小腸結(jié)腸炎(一種嬰兒中頻繁發(fā)生且常常是致命性的疾病)的情況下，最近使用大鼠模型顯示了由于單個(gè)分子二唾液酸乳-N-四糖而產(chǎn)生的保護(hù)作用(Jantscher-Krenn等，2012，Gut 61：1417-1425)。

與人乳相比，形成多數(shù)嬰兒配方食品之基礎(chǔ)的牛乳具有非常低的寡糖含量，具有不同的唾液酸化和巖藻糖基化譜。在模擬人乳的組成的嘗試中，奶粉配方目前補(bǔ)充有(非HMO的)GOS和FOS。然而，由于其缺乏唾液酸殘基，所添加的GOS和FOS不可能提供如上所述的HMO的治療益處(Bode，2012，同上)。

試圖使GOS和FOS唾液酸化依賴于聚糖唾液酸化，這可以化學(xué)地實(shí)現(xiàn)以及使用不同類型的酶以酶促法實(shí)現(xiàn)[1]。例如，來(lái)自克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)(查加斯病(Chagasdisease)的病原體)的轉(zhuǎn)唾液酸酶(trans-sialidase enzyme)(TcTS)已用于將唾液酸從供體轉(zhuǎn)移到接受體聚糖[2]。然而，在工業(yè)生產(chǎn)食品級(jí)HMO的情況下，克氏錐蟲(T.cruzi)轉(zhuǎn)唾液酸酶有一個(gè)主要的缺點(diǎn)，即它構(gòu)成了克氏錐蟲內(nèi)的一種重要的毒力因子[3]。