[發(fā)明專利]使用粘土礦物和堿性溶液制備含核酸樣品的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480025629.X
• 申請日: 2014-05-07
• 公開（公告）號: CN105189750B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設計）人: H·K·博扎克
• 申請（專利權）人: 珀金埃爾默健康科學有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 韓威威

本發(fā)明提供快速和高效的生物樣品制備方法，所述生物樣品用于同時檢測DNA和RNA靶分子。該方法包括用粘土礦物處理樣品，然后用堿性溶液裂解樣品。該方法特別適合于制備復雜生物樣品，例如血液和血漿，以用于同時檢測DNA和RNA靶。由本發(fā)明方法制備的樣品可直接用作PCR擴增中的靶。本發(fā)明的方法可以方便地與其它步驟和裝置偶聯，以進行用于診斷和其他應用的分子分析。

政府權益聲明

本文所述的工作由美國陸軍醫(yī)學研究購置活動(U.S.Army Medical ResearchAcquisition Activity)撥款提供部分資金，合同號為W81XWH-10-2-0158。美國政府對本發(fā)明享有一定的權利。

背景

技術領域

本發(fā)明一般地涉及用于處理樣品的方法，所述樣品用于分子診斷應用。

相關技術描述

許多診斷、研究、和研發(fā)程序需要檢測生物樣品中存在的特定核酸(DNA或RNA)序列。例如，核酸檢測方法用于鑒別細菌、病毒、或其它微生物，它們的存在可以說明感染性疾病的原因。核酸生物標志物是幾種對全球衛(wèi)生有高度重要性的感染性疾病，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、流行性感冒、和登革熱的目標分析物。更復雜樣本，例如人組織的樣品的測試也越來越普遍，其目的是確定與癌癥或遺傳病相關的突變的存在。生物組織，例如從犯罪現場直接采集的血液中的核酸的檢測，也被用于確定作為樣品來源的個體的身份，如，例如，親子鑒定或法醫(yī)分析。

在核酸分子可以進行上述所說的任何目的的檢測之前，必需使生物材料樣品中的特定的感興趣核酸達到可用的狀態(tài)。從生物樣本中釋放核酸的過程在本領域中通常被稱為“樣品制備”。靶核酸常常被包含在病毒顆粒、細菌細胞、真菌細胞、或更復雜的生物體的細胞，例如人白細胞內。

在樣品制備過程中，細胞或病毒顆粒可以進行化學或酶學處理以使膜和蛋白質包膜溶解或變性，從而導致核酸的釋放。這種溶解過程通常被稱為“裂解”，所得到的含有這種裂解物質的溶液被稱為“裂解物”或“提取物”。可惜地是，這種釋放使核酸暴露，會受到樣品中存在的內源核酸酶的降解，所述內源核酸酶存在的豐度可以使得在核酸釋放之后立即開始降解。在后續(xù)純化過程中殘余的任何核酸酶都可以繼續(xù)降解完整的核酸，導致靶分子從樣品中消失。核酸酶在大多數生物樣品中都是高豐度的，并且通常極能抵抗已知使其它酶失活的處理。特別是，核糖核酸酶(RNases)即使不是在所有的生物樣品中，也是在大部分生物樣品中是有活性的，特別是血液，而血液是最常收集的用于診斷目的的組織。除了核酸酶之外，許多其他蛋白質和污染物常常存在于生物樣品中，和/或在裂解物的制備過程中被釋放。例如，血液樣品可以包括血紅素和肝素(在抽血過程中使用的一種抗凝劑)，它們干擾和/或抑制許多下游的分析步驟。

為了克服生物裂解物中存在的核酸酶和其它不希望的產物的問題，有必要設計復雜的具有失活酶以及進一步純化核酸二者的方案。例如，陰離子去垢劑和離液劑，例如硫氰酸胍，已被用于在從細胞和亞細胞結構中釋放核酸的同時失活或抑制核酸酶活性。為了進一步從裂解物中純化核酸，本領域中通常是使用低分子量的醇類使核酸從溶液中沉淀。由于在這些條件下，其它大分子也會沉淀，產生包裹著核酸的粘性的、難處理的物質，在進行乙醇沉淀之前常常必需借助于含有酚、和/或氯仿的危險有機溶劑混合物來提取樣品。