[發(fā)明專利]由多能干細胞生成肝細胞和膽管細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480021570.7
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN105121632B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戈登·凱勒;小川新一郎;安納德·高內(nèi)卡;克里斯汀·貝爾;比妮塔·M·卡馬斯;小川美奈;詹姆斯·蘇拉比希特切特
• 申請（專利權(quán)）人: 大學(xué)健康網(wǎng)絡(luò);病童醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61K35/407;A61K35/37;A61P1/16;C12N5/0735;C12Q1/02
• 代理公司: 北京德恒律治知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11409
• 代理人: 章社杲;李偉

1.一種從人誘導(dǎo)多能干細胞群產(chǎn)生肝細胞和/或膽管細胞的方法，所述方法包括：

a)使作為單層培養(yǎng)或形成為胚狀體的所述人誘導(dǎo)多能干細胞與誘導(dǎo)培養(yǎng)基接觸4天-8天以提供誘導(dǎo)的內(nèi)胚層細胞群，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括ActA和Wnt/β-連環(huán)蛋白激動劑；

b)使所述誘導(dǎo)的內(nèi)胚層細胞群與nodal激動劑接觸1-4天，以提供延長的nodal激動劑處理的誘導(dǎo)的內(nèi)胚層細胞群；

c)將所述延長的nodal激動劑處理的誘導(dǎo)的內(nèi)胚層細胞群與特化培養(yǎng)基接觸4-10天，以獲得擴增的成肝細胞種群；所述特化培養(yǎng)基包括選自FGF2、FGF4和FGF10的FGF激動劑和選自BMP4、BMP2和BMP7的BMP4激動劑；

d)用包括HGF、Dex和OSM的成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)所述擴增的成肝細胞種群10天至14天；

e)通過酶處理和人工解離解離步驟d)獲得的所述成肝細胞種群；

f)生成所述解離的所述成肝細胞種群的聚集體，以及用包括HGF、Dex和OSM的成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)所述聚集體；

以及

g)使用cAMP類似物培養(yǎng)步驟f)獲得的所述聚集體6天至10天。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述延長的nodal激動劑處理的誘導(dǎo)的內(nèi)胚層種群包括至少80％、85％、90％、或95％的CXCR4和CKIT陽性細胞和/或至少70％、75％、或80％的SOX17⁺細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述FGF激動劑是FGF2。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述成肝細胞種群的聚集體包括至少70％、80％、85％或90％的白蛋白陽性細胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述cAMP類似物選自8-溴腺苷-3’5”-環(huán)單磷酸、丁酰-cAMP、腺苷3’,5’-環(huán)單硫代磷酸、SP-cAMP、8-溴腺苷-3’,5’-環(huán)單硫代磷酸和Sp-8-Br-cAMP。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，使用Wnt激動劑進一步培養(yǎng)所述成肝細胞種群的聚集體6天至10天。

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述Wnt/β-連環(huán)蛋白激動劑為Wnt3a。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，在步驟g)期間，所述成肝細胞種群的聚集體進一步與如下中的一種接觸：

a)Wnt/β-連環(huán)蛋白激動劑和TGFβ拮抗劑，以促進白蛋白+/HNF4+祖細胞種群的擴增；或

b)Wnt拮抗劑和Mek/Erk拮抗劑，以促進CYP酶的表達。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述TGFβ拮抗劑為SB431542，所述Wnt拮抗劑為XAV939，以及所述Mek/Erk拮抗劑為PD0325901。

10.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中，所述成熟培養(yǎng)基進一步包括促進肝細胞譜系特化的Notch拮抗劑。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述方法產(chǎn)生功能性肝細胞；

其中，與包括肝祖細胞和/或膽管祖細胞的細胞群的細胞相比，所述功能性肝細胞中，

選自由ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、NAT2和UGT1A1組成的組的至少一種蛋白質(zhì)的表達和/或活性獲得增加；和/或

選自由ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、NAT2和UGT1A1組成的組的至少一種基因的表達獲得增加。