[發明專利]真核生物中的靶向基因組工程

在審

• 申請號: 201480018807.6
• 申請日: 2014-03-31
• 公開（公告）號: CN105121650A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發明（設計）人: K·達倫
• 申請（專利權）人: 拜爾作物科學公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 張莉;黃革生

1.一種用于在預選位點修飾真核細胞的基因組的方法，該方法包括步驟:

a.通過如下方式在所述細胞的基因組中在位于雙鏈DNA斷裂誘導(DSBI)酶的識別位點或附近的切割位點處誘導雙鏈DNA斷裂(DSB)，其中所述方式為在所述細胞中表達識別所述識別位點并在所述切割位點誘導DSB的DSBI酶；

b.在所述細胞中引入修復核酸分子，其中所述修復核酸分子包含與所述預選位點的上游區域具有同源性的上游側翼區和/或與所述預選位點的下游DNA區域具有同源性的下游側翼區，以允許在所述一個或兩個側翼區和位于所述預選位點側翼的所述一個或兩個DNA區之間同源重組；

c.選擇在所述預選位點所述基因組被修飾的細胞，其中所述修飾選自：

i.至少一個核苷酸的替代；

ii.至少一個核苷酸的缺失；

iii.至少一個核苷酸的插入；或

iv.i.-iii.的任何組合,

該方法的特征在于，所述預選位點位于所述切割和/或識別位點之外。

2.權利要求1的方法，其中所述預選位點距離所述切割位點至少28bp。

3.權利要求1或2的方法，其中所述預選位點距離所述切割位點至少43bp。

4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述修復分子也包含DSBI酶的識別和切割位點，優選地在所述側翼區之一中。

5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述DSBI酶在誘導所述DSB后產生5’突出端。

6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述DSBI酶是TALEN。

7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述預選位點位于所述識別位點下游。

8.權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述修復分子是雙鏈DNA分子。

9.權利要求1-8中任一項的方法，其中所述修復分子包含目的核酸分子，其中所述目的核酸分子通過所述一個或兩個側翼DNA區和位于預選位點側翼的所述一個或兩個DNA區之間的同源重組，插至所述預選位點。

10.權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述修飾是至少43個核苷酸的置換或插入。

11.權利要求1-10中任一項的方法，其中通過向細胞中引入編碼DSBI酶的核酸分子，在所述細胞表達該DSBI酶。

12.權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述真核細胞是植物細胞。

13.權利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述目的核酸分子包含一個或多個可表達的目的基因，所述可表達的目的基因任選地選自:除草劑耐受性基因，昆蟲抗性基因，疾病抗性基因，非生物脅迫抗性基因，涉及油類生物合成、碳水化合物生物合成的酶，涉及纖維強度或纖維長度的酶，涉及次級代謝產物的生物合成的酶。

14.權利要求9-13中任一項所述的方法，其中所述目的核酸分子包含可選擇的或可篩選的標記基因。

15.權利要求12-14中任一項的方法，其中所述預選位點位于原種事件的側翼區中。

16.如權利要求1-15中任一項所述的方法，包括進一步的步驟：使所述選擇的真核細胞生長為真核生物。

17.DSBI酶的用途，用于在位于所述DSBI酶的切割位點和/或識別位點之外的預選位點處修飾基因組。

18.權利要求17的用途，其中所述DSBI酶是在切割后產生5’突出端的DSBI酶，或所述DSBI酶是TALEN或ZFN。