[發明專利]蛋白質的制造方法

有效

• 申請號: 201480018249.3
• 申請日: 2014-03-26
• 公開（公告）號: CN105358682B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 上野智規;多賀祐喜;后藤希代子;加來祐子
• 申請（專利權）人: 日本皮革株式會社
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K45/00;A61K48/00;A61P11/00;A61P43/00;C12N15/09;C12P21/02
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 鄭天松

在高效率的蛋白質合成中，mRNA上附著多數的核糖體的多核糖體形成的促進被認為非常地有效，但不清楚p180蛋白質的多核糖體形成的促進功能的結構。本申請的發明人新發現，作為與作為p180蛋白質的多核糖體形成促進功能的責任區域的卷曲螺旋結構域特異性地相互作用的蛋白質、作為促進mRNA的小胞體(ER)定位的蛋白質的SF3b4蛋白質，然后知，在高表達促進mRNA的小胞體(ER)定位的蛋白質(例如SF3b4蛋白質)和p180蛋白質的兩方的細胞中，mRNA的向小胞體上的定位顯著地升高，使培養細胞的分泌功能升高變得可能。另外顯示，通過在表達質粒中插入特定的核苷酸序列，將有表達蛋白質的增強效果的SF3b4蛋白質在小胞體膜上定位、及使多核糖體中mRNA重量化變動變得可能，經其可增強細胞的分泌能力。

【技術領域】

本申請涉及用于使重組細胞中的自外來性基因的蛋白質的表達亢進的重組細胞、以及涉及利用那樣的細胞的發明。更具體涉及，利用使p180蛋白質的表達、及/或SF3b4蛋白質的表達均亢進的細胞、或者有這樣的特征的細胞，使作為目的物的蛋白質的合成能力或分泌能力亢進，作為結果提供制造蛋白質的方法。利用有上述特征的細胞，使作為目的物的蛋白質的合成能力或分泌能力亢進，在作為其結果制造蛋白質的方法中，在用于作為目的物的蛋白質表達的載體中利用順式-元件也作為另外的特征。

【背景技術】

應用基因重組技術的生物技術藥品，近年、特別在抗體藥品市場急速擴大，向其醫療費的負荷也變得危險，常常要求可相比以往更有效進行蛋白質生產，成本更低的生物技術藥品的制造技術的開發。

作為用于利用基因重組技術的蛋白質生產的宿主，至今利用，動物細胞、酵母、大腸桿菌等。大腸桿菌等可以低成本生產作為目的物的蛋白質，但無法進行糖鏈修飾等的翻譯后修飾，在糖蛋白質的生產不適宜。另外，大腸桿菌有易制作含生產的蛋白質的包含體的性質，在作為目的物的蛋白質的取得中，合成后，進一步增溶過程變得必要，存在作業負荷高的缺點。

特別是，抗體等的糖蛋白質的情況中，附加的糖鏈由于對作為目的物的蛋白質的水溶性、對蛋白酶的抵抗性、組織目標性、還有其生物活性也有影響，必要使用作為高等真核生物的動物細胞的生產技術，近年其技術大大進步。那樣的狀況的原來、現在的抗體藥品的多數在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中生產，但其制造過程的優化依然是重要的課題。

從含哺乳動物細胞的真核生物細胞向細胞外分泌的蛋白質在作為被內膜隔開的細胞器的小胞體中合成。小胞體被大分為在表面具有由RNA-蛋白質的巨大復合物組成的蛋白質合成裝置的核糖體的粗面小胞體和無核糖體的滑面小胞體的2種，但不知粗面小胞體的詳細的形成結構。

在活體內，存在專門從事特定的蛋白質的分泌的專門分泌細胞(professionalsecretory cells)，在它們的細胞中粗面小胞體顯著地發達，被認為可進行高效率的蛋白質生產。例如分泌膠原的成纖維細胞、分泌消化酶組的胰腺線房外分泌細胞等對應于那樣的專門分泌細胞。與這些的專門分泌細胞比較，多用于現在基因工程學蛋白質生產的CHO細胞、HEK293細胞等有粗面小胞體非常地少量，分泌活性低的問題。

在利用基因重組技術生產生物技術藥品時，作為目的物的蛋白質的基因在表達載體中顯示高的轉錄活性的啟動子的控制化，預計其mRNA以高水平表達。但是，即使置于那樣的狀況下，也屢屢發生mRNA水平和蛋白質表達量本身不相關的情況，作為其一原因可舉在小胞體膜上的翻譯效率的低。

即認為，在多用于現在這些的基因工程學蛋白質生產的細胞中，只要可對于在小胞體膜上的翻譯裝置易利用的形式提供mRNA，就與成纖維細胞的情況同樣地，留有可越發增強蛋白質合成能力的余地。

在恒定分泌膠原的成纖維細胞中，編碼膠原蛋白質的mRNA時常高水平表達，其大部分在分泌蛋白質的生物合成的場所的小胞體膜上被檢測(非專利文獻1)。但是，為了使膠原合成活化，僅在小胞體上存在其mRNA是不充分的，使翻譯效率高的多核糖體形成變得必要。