[發(fā)明專利]用于標(biāo)記和分析樣品的方法和組合物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480016213.1
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN105189749B
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 海-姆·克里斯蒂娜·范;愛德華·A·哈欽斯
• 申請（專利權(quán)）人: 血統(tǒng)生物科學(xué)公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6816
• 代理公司: 上海勝康律師事務(wù)所 31263
• 代理人: 樊英如;李獻(xiàn)忠

本發(fā)明涉及標(biāo)記樣品中的分析物的方法。

交叉引用

本申請要求申請日為2013年3月15日的美國臨時(shí)申請No.61/801785和申請日為2013年3月28日的美國臨時(shí)申請No.61/806143的優(yōu)先權(quán)，這兩個(gè)申請的全文內(nèi)容都通過引用并入本申請。

背景技術(shù)

對生物樣品中的核苷酸和蛋白質(zhì)的分析是分子生物學(xué)領(lǐng)域的基本內(nèi)容。檢測、鑒別和利用遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)信息的能力使得能進(jìn)行靈敏性和特異性診斷以及治療。

提供本發(fā)明以在單一細(xì)胞水平快速標(biāo)記和分析核苷酸和蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了標(biāo)記靶寡核苷酸的方法，其包括以下步驟：(a)將DNA分入多個(gè)區(qū)室(compartment)中；(b)在區(qū)室內(nèi)進(jìn)行DNA的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而獲得含有RNA的區(qū)室；(c)使含有RNA的區(qū)室內(nèi)部(interior)與含有靶寡核苷酸的成組的區(qū)室內(nèi)部合并；(d)使RNA與靶寡核苷酸進(jìn)行雜交；以及(e)進(jìn)行反應(yīng)，以將對應(yīng)RNA的序列附接到靶寡核苷酸。

在一些實(shí)施例中，DNA是雙鏈的。

在一些實(shí)施例中，區(qū)室是油和水乳劑內(nèi)的液滴(droplet)。

在一些實(shí)施例中，靶寡核苷酸包括至少一個(gè)包含細(xì)胞標(biāo)記和分子標(biāo)記的靶寡核苷酸。

在一些實(shí)施例中，靶寡核苷酸為DNA。

在一些實(shí)施例中，所述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：在步驟(c)的合并前，將靶寡核苷酸分到成組的區(qū)室中。

在一些實(shí)施例中，所述的方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：在步驟(c)的合并前，將成組的細(xì)胞分到各區(qū)室并且使細(xì)胞裂解，以釋放細(xì)胞寡核苷酸。例如，細(xì)胞寡核苷酸為靶核苷酸。替代地，細(xì)胞寡核苷酸是細(xì)胞mRNA。

在一些實(shí)施例中，所述的方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：進(jìn)行細(xì)胞mRNA的反向轉(zhuǎn)錄，以生成細(xì)胞cDNA。

例如，所述的反向轉(zhuǎn)錄反應(yīng)利用對基因組區(qū)有特異性的引物執(zhí)行。所述的基因組區(qū)域可以是免疫球蛋白基因或T細(xì)胞受體基因。

例如，所述的反向轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以在合并步驟前在成組的區(qū)室內(nèi)進(jìn)行。

替代地，所述的反向轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以在合并后的區(qū)室內(nèi)進(jìn)行。

在一些實(shí)施例中，靶核苷酸是細(xì)胞cDNA。

在一些實(shí)施例中，反應(yīng)為cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)反應(yīng)。

在一些實(shí)施例中，DNA與固相支持物偶聯(lián)。例如，固相支持物為磁珠(bead)。

本發(fā)明還提供一種方法，其包括以下步驟：(a)提供多個(gè)包含多個(gè)DNA寡核苷酸的磁珠；(b)提供多個(gè)含引物序列、通用序列、接頭(adapter)序列和細(xì)胞標(biāo)記的DNA寡核苷酸；(c)將步驟(a)中的磁珠與步驟(b)中的寡核苷酸融入多個(gè)區(qū)室，使得每個(gè)區(qū)室含有單個(gè)的磁珠和單個(gè)的寡核苷酸；(d)在區(qū)室內(nèi)，進(jìn)行寡核苷酸的擴(kuò)增反應(yīng)，從而獲得多個(gè)包含RNA所述引物序列、通用序列、接頭序列和細(xì)胞標(biāo)記的DNA寡核苷酸；(e)進(jìn)行在區(qū)室內(nèi)的體外DNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而獲得含有引物序列、通用序列和細(xì)胞標(biāo)記的區(qū)室；(f)將含有RNA的區(qū)室內(nèi)部與含有靶核苷酸的成組的區(qū)室內(nèi)部合并；(g)使RNA與靶寡核苷酸雜交；和(h)進(jìn)行反應(yīng)，以將相應(yīng)的RNA的序列附接到靶核苷酸。

在一些實(shí)施例中，磁珠上的多個(gè)寡核苷酸包括分子標(biāo)記。

本發(fā)明進(jìn)一步提供標(biāo)記靶寡核苷酸的方法，其包括以下步驟：(a)從包含多種細(xì)胞類型的生物樣品中分離多個(gè)mRNA；以及(b)采用靶核苷酸的特異性引物和含有分子標(biāo)記、通用序列和接頭序列的模板切換寡核苷酸，進(jìn)行mRNA的反向轉(zhuǎn)錄，以生成標(biāo)記靶cDNA。