[發(fā)明專利]使用雜合CHEF1啟動子的改善重組蛋白表達

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480014593.5
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN105209625B
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 霍華德·R·克拉可
• 申請（專利權(quán)）人: CMC依科斯生技制品公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/67
• 代理公司: 北京銀龍知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11243
• 代理人: 許靜;黃燦

本發(fā)明提供用于高水平表達重組蛋白的表達載體和宿主細胞。所述表達載體包含中國倉鼠卵巢延長因子1?α(CHEF1)轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA元件和巨細胞病毒(CMV)啟動子和/或人腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)(AdTPL)序列。與以前描述的表達系統(tǒng)相比，本發(fā)明實現(xiàn)宿主細胞的增加蛋白表達和更好的產(chǎn)率。

本申請含有呈計算機可讀形式的序列表(文件名：44744A_SeqListing.txt；大小：37,528字節(jié)；創(chuàng)建：2014年3月11日)作為公開內(nèi)容的單獨部分，所述內(nèi)容以全文引用的方式并入本文。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2013年3月12日提交的美國臨時專利申請序列號61/777,603的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。所述優(yōu)先權(quán)申請的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明針對包含新穎啟動子-增強子組合的表達載體，所述啟動子-增強子組合增強異源蛋白表達并且在重組蛋白生產(chǎn)的領(lǐng)域中具有實際應(yīng)用。

背景技術(shù)

通過轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和/或分泌中的改善而增加的重組蛋白表達是基本優(yōu)先的用于在細胞系發(fā)展期間優(yōu)化產(chǎn)量。中國倉鼠卵巢延長因子1-α(CHEF1)表達系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛使用以創(chuàng)建用于產(chǎn)生重組蛋白的臨床細胞系。延長因子1-α(EF-1α)基因在大多數(shù)組織類型中高度表達，并且EF-1是人細胞中最豐富的蛋白質(zhì)之一(Beck等，Molecular SystemsBiology 7:549；2011)。CHEF1表達載體實現(xiàn)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中以及在非倉鼠細胞中的高水平重組蛋白表達。

CHEF1表達與生長相協(xié)調(diào)，使得滴定度增加由增加的體積產(chǎn)率來驅(qū)動。通常，蛋白表達在生長的指數(shù)期早期啟動并且在靜止期期間下降且衰退。蛋白表達和細胞生長之間的聯(lián)系與天然EF-1α基因的調(diào)控是一致的，所述天然EF-1α基因被組成型表達以在核糖體蛋白復(fù)合物中發(fā)揮作用。EF-1α的表達已經(jīng)被證明在轉(zhuǎn)化的細胞(Sanders等，Nucleic AcidsResearch 20:5907；1992)和絲裂原刺激的細胞(Thomas和Thomas,Journal ofCellBiology 103:2137；1986)中增加，這與EF-1α在活躍生長細胞中的組成型表達是一致的。除了生長的細胞的轉(zhuǎn)錄控制，胰島素生長因子通過mRNA 5'非翻譯區(qū)(5'UTR)來調(diào)控EF-1α的翻譯(Hammond和Bowman,Journal of Biological Chemistry 25:17785；1988；Proud和Denton,Biochemical Journal 328:329；1997)。通過在5'UTR中發(fā)現(xiàn)的多嘧啶系統(tǒng)(TOP)序列來實現(xiàn)這種翻譯控制(Mariottini和Amaldi,Molecular and Cellular Biology 10:816；1990)。

CHEF1表達系統(tǒng)已經(jīng)示出能夠?qū)崿F(xiàn)比采用其他常用啟動子(例如，巨細胞病毒(CMV)、人EF-1α以及猿猴病毒40(SV40)啟動子)的載體更高水平的蛋白表達(Running Deer和Allison,Biotechnology Progress 20:880；2004)。CMV啟動子是用于重組蛋白表達最廣泛使用的啟動子之一。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系統(tǒng)使用鼠科或人CMV啟動子(Kalwy,S.,Towards stronger gene expression-a promoter's tale,第19屆歐洲動物細胞技術(shù)(ESACT)學(xué)院會議,2005)。商業(yè)表達質(zhì)粒pcDNA^TM3(Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)攜帶來源于之前描述的主要立即早期(IE)基因(GenBank Accession#K03104.1)的CMV啟動子(Boshart等，Cell 1985；4:521)。另一個常用的CMV啟動子來源于人CMV株AD 169(GenBank Accession#X17403.1)，也稱為人皰疹病毒5。