[發明專利]從凝結芽孢桿菌中產生部分純化的細胞外代謝產物的方法及其生物應用

有效

• 申請號: 201480010615.0
• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN105189733B
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發明（設計）人: 穆罕邁德.瑪杰德;K.納加布沙納姆;S.阿魯瑪蓋姆;F.阿利
• 申請（專利權）人: 穆罕邁德.瑪杰德
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝;易方方

1.用于從益生菌菌株凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)MTCC 5856中產生部分純化的細胞外代謝物制劑的純化方法，所述菌株表現出與已知細菌菌株凝結芽孢桿菌ATCC31284、凝結芽孢桿菌NBRC 3887和凝結芽孢桿菌ATCC 7050具有99％遺傳同源性，所述純化方法包括以下步驟：

a.將表現出與已知細菌菌株凝結芽孢桿菌ATCC 31284、凝結芽孢桿菌NBRC 3887和凝結芽孢桿菌ATCC 7050具有99％遺傳同源性的凝結芽孢桿菌MTCC 5856接種到1.0升的葡萄糖酵母提取物醋酸鹽肉湯培養基或含0.5％tween 80的MRS肉湯培養基或玉米漿干粉培養基中；

b.在37℃，120rpm下在步驟a的接種過的培養基中進行發酵24-48h；

c.在4000-7000rpm下離心步驟b的發酵肉湯；

d.在50℃下通過利用旋轉蒸發器濃縮步驟c的上清液10倍；

e.向步驟d的100ml的10倍濃縮上清液中逐滴加入150ml冰冷的丙酮，然后混合；

f.將步驟e的混合物在0℃孵育30分鐘，然后在7000-8000rpm下離心；

g.棄去步驟f中獲得的沉淀物并收集60％丙酮飽和的上清液200ml；

h.通過旋轉蒸發器濃縮步驟g中的丙酮飽和的上清液至50ml；

i.利用4N HCl調節pH至5.0，過濾并在進一步使用之前貯存在-20℃，其中所述過濾步驟使用0.22微米的由印度生產的Millex Millipore；

j.冷凍干燥/噴霧干燥/托盤干燥步驟h的上清液；

其中所述凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)MTCC 5856保藏于微生物菌種保藏與基因庫(Microbial Type Culture Collection and Gene Bank)，并分配菌株號MTCC 5856。

2.一種微生物控制的方法，所述方法包括步驟：將有效濃度的根據權利要求1所述方法制備的部分純化的細胞外代謝物制劑與靶微生物細胞相接觸。

3.權利要求2所述的方法，其中所述微生物細胞是選自包含以下的組中之一：銅綠假單胞菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，變形鏈球菌，痤瘡丙酸桿菌，蠟狀芽孢桿菌和阿博尼沙門氏菌。

4.一種微生物控制的方法，所述方法包括步驟：將微生物細胞與有效濃度的基本上由權利要求1所述方法制備的部分純化的細胞外代謝物組成的制劑和防腐劑共混物相接觸，所述防腐劑共混物包括61％w/w的百里酚，38％w/w的甘油一月桂酸酯和獲自木蘭(Magnolia officinalis)的超臨界流浸膏的1％w/w的木蘭醇。

5.權利要求4所述的方法，其中所述微生物細胞是選自包含以下的組中之一：銅綠假單胞菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，變形鏈球菌，痤瘡丙酸桿菌，蠟狀芽孢桿菌和阿博尼沙門氏菌。

6.一種抑制微生物生物膜形成的方法，所述方法包括步驟：將產生物膜的微生物細胞與基本上由權利要求1所述方法所制備的的部分純化的細胞外代謝物組成的制劑單獨地相接觸，或與防腐劑共混物組合的所述制劑相接觸，所述防腐劑共混物包括61％w/w的百里酚，38％w/w的甘油一月桂酸酯和獲自木蘭的超臨界流浸膏的1％w/w的木蘭醇。

7.權利要求6所述的方法，其中所述產生物膜的微生物細胞是選自包含以下的組中之一：銅綠假單胞菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，變形鏈球菌。

8.一種在蔗糖存在下防止pH下降并進一步防止變形鏈球菌的生物膜聚集的方法，所述方法包括步驟：將產生物膜/斑變形鏈球菌與基本上由權利要求1所述方法所制備的部分純化的細胞外代謝物組成的制劑單獨相接觸，或與防腐劑共混物組合的所述制劑相接觸，所述防腐劑共混物包括61％w/w的百里酚，38％w/w的甘油一月桂酸酯和獲自木蘭的超臨界流浸膏的1％w/w的木蘭醇。