[實用新型]用于檢測外周血循環腫瘤細胞的試劑盒

有效

• 申請號: 201420430304.7
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN204086278U
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 張益清;李微;王緒華;梁超;陳忠;方國偉;黃士昂
• 申請（專利權）人: 北京海思特臨床檢驗所有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

技術領域

本發明屬于分子細胞生物學領域，涉及一種用于檢測外周血循環腫瘤細胞的試劑盒。

背景技術

利用現代免疫和分子技術，惡性腫瘤患者外周血中的腫瘤細胞根據其細胞學特征可以被檢測出來。能夠方便的檢測和定位這樣的細胞將會對惡性腫瘤早期診斷，化療調整，早期復發的預防和靶向治療產生深遠的影響。當1889年StevenPaget發表了關于“種子和土壤”的學說后，血液播散細胞的想法應運而生。一個多世紀以后，隨著分子技術的成熟，新的臨床發現解釋了曾經不能解釋的現象，比如遠處器官出現另外和原位瘤同樣病理特征的腫瘤，對于上皮細胞起源的實體瘤，許多病人的外周血中都可以檢測到循環腫瘤細胞。循環腫瘤細胞不僅存在于已經發生腫瘤遠處轉移的患者，同樣也存在于那些腫瘤尚局限的患者。特別值得注意的是，這種方法在惡性腫瘤化療調整的風險評估和利用循環腫瘤細胞的分子學特征研究新的靶向治療具有很重要的意義。

研究目前所存在的檢測技術大多是在大劑量化治療前，抽取骨髓或提取單個核細胞來檢測微小轉移是否發生。抽取骨髓耗時較長，而且對患者而言有一定的痛苦，事實上，現在臨床對于乳腺癌的治療已經很少用到大劑量的化療了。因此，現階段很多研究都比較關注外周血循環腫瘤細胞的檢測，不過檢測的基本原理幾乎還是相同的。用于檢測循環腫瘤細胞的方法大體上可以分為兩類，一類是細胞計數分析，一類是核酸檢測。細胞計數法是根據免疫細胞化學技術來鑒定和確定個體腫瘤細胞的特征。核酸檢測技術是通過檢測腫瘤細胞和正常人細胞中不同個體腫瘤細胞的特征。核酸檢測技術是通過檢測腫瘤細胞和正常人細胞中不同表達的DNA或RNA序列來實現的。

細胞計數法為通過提取和計數個體細胞來實現。該方法的一個優勢在于可以通過其表達的關鍵的生物標志，如人上皮生長因子受體-2(HER2)和上皮生長因子受體(EGFR)，進一步分析細胞分子水平的生物學特征。盡管如此，即便是在已經發生轉移的腫瘤患者外周血中也只能檢測到很少數量的上皮細胞(小于10個細胞/ml)，所以在這些細胞從血液成分中分離出來前需要進行富集。

許多研究者已經通過免疫磁珠的方法來進行細胞富集。通常市面上可以買到的試劑盒或常規方法包括磁性吸引細胞分選系統(MACS系統)、磁珠、以及鐵磁流體系統。MACS系統和磁珠系統都通過抗體連接到順磁體磁珠上，通過不同的磁性吸引來分選特定的細胞。磁珠可以連接到陽性選擇的抗上皮細胞抗體上(如HEA125，cytokeratin7/8,BerEP4)或者直接連接到單克隆抗體CD45，來選定陰性表達的白細胞。從發生轉移的乳腺癌患者外周血中分離得到的cytokeratin陽性細胞。通過免疫磁性法富集分離血細胞，染上抗cytokeratin8/18,生物素，異硫酸氫鹽熒光素(綠色熒光)。細胞核用碘化丙啶染色(紅色熒光)。其他的富集方法包括密度梯度離心和濾器濾過方法。濾器濾過是根據白細胞直徑大小，允許較小的白細胞通過，而較大的腫瘤細胞留在了濾器內。

盡管對細胞進行富集，但上皮細胞仍然大大小于殘留的白細胞的數量，因此，我們需要更進一步的檢測到這些上皮細胞。免疫化學方法是建立在利用單克隆抗體抗各種上皮細胞抗原的基礎上。利用免疫化學技術來掃描大量的細胞是相當耗時的；自動化成像分析系統或者半自動分選技術如流式或激光掃描細胞計數是比較適合的。本方法采用單一的腫瘤相關抗原的檢測，特異性和靈敏性稍低。

采用核酸檢測技術，即在腫瘤患者的血液中可以檢測到與腫瘤相相關的關的DNA/mRNA，然后可以用采用PCR/RT-PCR的方法檢測,方法學涉及到幾個步驟，具體步驟為，首先采用密度梯度離心法從外周血中提取單個核細胞，或采用免疫磁性分離技術從外周血中富集上皮細胞，然后采用標準方法提取細胞中的核酸，最后通過特異性引物PCR擴增。該方法缺乏細胞形態的支持，特異性低。

實用新型內容

為了解決上述技術問題，本實用新型的目的在于提供一種用于檢測外周血循環腫瘤細胞的試劑盒，可以快速、簡便、準確地檢測外周血循環腫瘤細胞。