[實(shí)用新型]副雞嗜血桿菌pyrG基因PCR檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201420065510.2
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN203768362U
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳憶春;苗立中;李金霞;趙自國;吳彬;趙霞
• 申請（專利權(quán)）人: 濱州職業(yè)學(xué)院
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/21
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本實(shí)用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及副雞禽桿菌pyrG基因檢測試劑盒，是通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出939bp的基因片段，檢測發(fā)病雞群中病雞的眶下竇分泌物中存在的副雞嗜血桿菌的PCR檢測試劑盒。?

背景技術(shù)

雞傳染性鼻炎(infectious?coryza?IC)是由副雞嗜血桿菌(Haemophilus?paragallinarum?Hpg)引起的一種雞的急性上呼吸道感染及毒素作用疾病。造成的最大損失是蛋雞產(chǎn)蛋率的下降(10％-40％)及育成雞和肉雞的生長不良和淘汰率增加，給養(yǎng)雞業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。按Page的分型方法，可將副雞嗜血桿菌分為A、B和C三個(gè)血清型，各血清型之間沒有交叉保護(hù)，B型的免疫保護(hù)有一定的型特異性，所以了解病原的血清型分布可以更好的預(yù)防和控制本病。?

已采用的幾種血清學(xué)方法中，血凝抑制試驗(yàn)幾乎是早期診斷傳染性鼻炎最合適的方法，三個(gè)血清型中有些共同抗原，所以用單一血清型制備的抗原仍有可能檢出不同型的凝集素。HI抗體的產(chǎn)生晚于凝集抗體和瓊擴(kuò)抗體，所使用的HI抗原主要用于A血清型菌株的測定；C型菌株作HI試驗(yàn)時(shí)，抗原需用硫氰化鉀處理，超聲波裂解，紅細(xì)胞需要用戊二醛處理稀釋液為含0.1％牛血清白蛋白的PBS。但此法不適于早期感染或免疫雞的抗體水平。?

目前比較成功的是DNA探針和PCR技術(shù)，陳小玲等于1996年從其建立的HpgDNA文庫中篩選出了4個(gè)種特異性片斷并用地高辛進(jìn)行標(biāo)記，可檢測純化DNA量均在7.8-31.25ug之間.通過對最小探針部分序列的測定，設(shè)計(jì)了兩對PCR引物，建立了兩種PCR診斷方法，在對41個(gè)Hpg分離株測定時(shí)，結(jié)果均為陽性，而對26個(gè)非Hpg的測定.結(jié)果均為陰性，并均能檢測出Hpg的DNA10³-10³個(gè)菌細(xì)胞。該方法良好的特異性和敏感性使之可以用來直接檢測Hpg，用于臨床上直接樣品的檢測，從而提高了診斷的敏感性，但不能夠應(yīng)用于血清型的分類。而宋敏訓(xùn)等在2001年建立的aroA-PCR的敏感性更是進(jìn)了一大步。他們利用aroA基因設(shè)計(jì)了1對引物.分別對10株標(biāo)準(zhǔn)副雞嗜血桿菌(Hpg)菌株、14株分離的Hpg菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增.結(jié)果均得到了與預(yù)期大小一致的片段.而對10株非Hpg菌株和3株病毒進(jìn)行擴(kuò)增則無相應(yīng)片段產(chǎn)生；該P(yáng)CR能檢到出10個(gè)菌細(xì)胞。?

細(xì)菌分離是檢測病雞病料中副雞禽桿菌常用的方法，但副雞禽桿菌的生長依賴NAD，對細(xì)菌的分離培養(yǎng)可按常規(guī)操作將病料接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基(在金黃色葡萄球菌劃線附近生長)，補(bǔ)充NAD的雞肉湯培養(yǎng)基。細(xì)菌的分離培養(yǎng)對確診是十分有必要的，但往往不能成功，?這是因?yàn)楦彪u禽桿菌十分嬌嫩，難以滿足其生長需要。而PCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)，所需病料組織少，敏感，方便等優(yōu)點(diǎn)已得到世界公認(rèn)，廣泛應(yīng)用于各種微生物、病原體等多種動(dòng)物病原的臨床檢測和病原確診。?

發(fā)明內(nèi)容

本實(shí)用新型的目的是為克服細(xì)菌分離鑒定分離率成功率不高，無法確診，檢測成本高的不足之處，采用PCR技術(shù)，提供一種副雞禽桿菌pyrG基因檢測試劑盒。?

本實(shí)用新型試劑盒包括由盒本體，在本體內(nèi)從上至下依次設(shè)置有第一海綿墊、隔離硬紙板、第二海綿墊，第一海綿墊上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放置：10×PCR?Buffer(含Mg2+)試劑管、dNTP試劑管、引物pyrG?A試劑管、引物pyrG?B試劑管，第二海綿墊上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放置：TaqDNA聚合酶試劑管、Marker?DL-2000試劑管、陰性對照試劑管、陽性對照試劑管，盒本體1底層放置說明書。?

檢測用引物有兩對：上游，pyrG?A；下游：pyrG?B。?

pyrG?A上游5-GCGGGACACGATGTGGCTAT-3?

pyrG?B下游5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3?

對照品分為陽性對照和陰性對照，陰性對照為陽性對照，陽性對照為副雞禽桿菌Apg-8標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC254)購自中國獸藥監(jiān)察所。?

本試劑盒保存于4℃，盡量減少反復(fù)凍融。?

本實(shí)用新型主要用于在病雞眶下竇組織中檢測細(xì)菌來對雞群進(jìn)行疫病診斷和病原確診，從而指導(dǎo)臨床病雞群的臨床用藥和飼養(yǎng)管理，預(yù)防副雞禽桿菌的發(fā)病和健康雞死亡，減少養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖戶的損失。?