[發(fā)明專利]利用DNA紋身免疫制備抗體的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410857000.3
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104479016A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 洪揚;劉明
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州吉賽生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/24
• 分類號: C07K16/24;C07K16/42;C07K16/06
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗體制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用DNA紋身免疫制備抗體的方法。

背景技術(shù)

抗體指機體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖分化成的漿細胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于組織液及外分泌液中。1964年，世界衛(wèi)生組織舉行專門會議，將具有抗體活性以及與抗體相關(guān)的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白(Ig)，如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血癥、冷球蛋白血癥等患者血清中存在的異常免疫球蛋白以及正常人天然存在的免疫球蛋白亞單位等。

傳統(tǒng)抗體生產(chǎn)方法中，免疫動物主要用兩類免疫原物質(zhì)，一是針對抗體靶點所設(shè)計的多肽分子；第二類是在大腸桿菌或真核細胞中表達的重組蛋白。而由此產(chǎn)生的抗體長期存在一些難以解決的問題。比如多肽免疫存在免疫原性差，且本身缺乏空間構(gòu)像的缺點，因而產(chǎn)生的抗體往往親和力低，不能與天然蛋白結(jié)合。而且免疫成功率低,一般小于50％。而在細菌中表達的重組蛋白不具有真核細胞蛋白固有的折疊，構(gòu)象與修飾，因而產(chǎn)生的抗體往往也不理想。真核表達系統(tǒng)可以制造出具有天然構(gòu)象的抗原蛋白，但由于表達量低且制作成本高，也不宜于大量使用。而且抗原蛋白與免疫佐劑混合過程中也會改變其性狀與構(gòu)象，降低抗原的免疫原性，導(dǎo)致抗體的滴度和特異性不高。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用DNA紋身免疫制備抗體的方法，采用DNA質(zhì)粒免疫動物的方法取代傳統(tǒng)的肽鏈及蛋白質(zhì)免疫，解決傳統(tǒng)抗體生產(chǎn)方法中存在的抗體滴度低，特異性差及不能識別天然抗原表位的缺陷。

為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

利用DNA紋身免疫制備抗體的方法，該方法包括

1)構(gòu)建抗原蛋白表達載體的步驟：將目的基因的cDNA片斷通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增的方式從宿主細胞基因組中調(diào)出，然后克隆到表達載體中；

2)制備純化的質(zhì)粒DNA：利用大腸桿菌大量制備純化的質(zhì)粒DNA；

3)質(zhì)粒DNA免疫：將質(zhì)粒DNA紋身的方式注射入動物表皮內(nèi)進行表達及免疫；

4)分離和純化抗體：采用雜交瘤篩選單克隆抗體分離純化或收集血清進行多克隆抗體提取純化。

具體地，步驟1)中采用pcDNA3.1真核細胞表達載體，將目的基因插入到表達載體上的NheI/EcorI雙酶切位點之間；構(gòu)建好的載體經(jīng)測序驗證以確保目的基因序列的正確性以及序列已正確插入到載體上的蛋白表達閱讀框內(nèi)。

具體地，步驟2)具體為：將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入到DH5α大腸桿菌宿主細胞內(nèi)進行擴增；擴增完成后提取和純化質(zhì)粒。

具體地，本發(fā)明采用Qiagen的無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取和純化質(zhì)粒。

具體地，所述步驟3)包括以下步驟：

S1：選擇動物后腿側(cè)面為紋身部位，對動物進行麻醉，待動物進入麻醉狀態(tài)后，電動剃毛器去除需紋身部位及周邊的毛發(fā)，并清理干凈；

S2：將純化好的DNA質(zhì)粒涂抹于1cm²范圍內(nèi)的上述剔除毛發(fā)的部位，用針頭對其進行紋身，完成紋身后用干凈的棉拭子在紋身皮膚表面涂上止痛霜劑，并且每兩周重復(fù)紋身免疫一次；

S3：免疫期間取血做ELISA及Western?blot檢測；

S4：待ELISA滴度達到1：8000以上且大于陰性對照3個標(biāo)準(zhǔn)差且Westernblot檢測看到正確的陽性條帶時進行脾細胞的融合或血清的收集和純化；在融合或純化血清前3天肌肉下注射純化的DNA質(zhì)粒一次進行強化免疫。

具體地，上述步驟5)中所述動物選自小鼠或新西蘭白兔。

具體地，步驟4)中從血清中提取和純化抗體的方法為鹽析法、柱層析純化、親和層析純化或離子交換層析中的一種或兩種以上結(jié)合。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1.本發(fā)明的方法中，DNA質(zhì)粒進入上皮細胞內(nèi)后，細胞蛋白機器合成抗原蛋白質(zhì)，且合成的蛋白不存在原核表達中的分子折疊，構(gòu)像及糖基化修飾缺陷等問題；抗原蛋白可以長時間，持續(xù)地在上皮細胞內(nèi)表達；

2.本發(fā)明的方法中，采用普通紋身器械將一定數(shù)量的DNA質(zhì)粒通過上萬次的穿刺注射入動物的皮內(nèi)，并采用多次免疫的方式產(chǎn)生的抗原經(jīng)過皮膚組織內(nèi)豐富的抗原呈遞細胞的處理與傳遞，激活T輔助性淋巴細胞進而活化B細胞分泌抗體的功能，從而產(chǎn)生親和力與特異性具佳的高質(zhì)量抗體；

3.通過本發(fā)明的方法免疫原刺激產(chǎn)生的抗體能夠識別天然構(gòu)象的蛋白，因而在臨床診斷試劑和抗體藥物研發(fā)方面具有重要的應(yīng)用價值；