[發(fā)明專利]一種豬促卵胞激素α-亞基的編碼基因FSHα及其篩選方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410854498.8
• 申請(qǐng)日: 2014-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN104593376A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李寧;李秋艷;王明;孫照霖;康倩倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/16
• 分類號(hào): C12N15/16;C07K14/59;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的涉及一種豬促卵胞激素α-亞基的編碼基因FSHα及其篩選方法。

背景技術(shù)

促卵泡激素，亦稱為卵泡刺激素(Follicle-Stimulating?Hormone，F(xiàn)SH)，因最早發(fā)現(xiàn)其對(duì)雌性動(dòng)物卵泡成熟的刺激作用而得名。促卵泡激素是動(dòng)物垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，與促黃體激素、促甲狀腺激素、及胎盤產(chǎn)生的絨毛膜促性腺激素共同組成一個(gè)糖蛋白激素家族。它們的功能各異，結(jié)構(gòu)卻極為相似，都是由α-亞基和β-亞基所組成。在同一物種內(nèi)α-亞基是確定的，它們的α-亞基可以互換，而β-亞基不能互換，β-亞基具有激素各自的特異性，又具有種間特異性，是激素生物活性和免疫活性的決定因素。α-亞基和β-亞基單獨(dú)都不具有生物活性，只有當(dāng)兩者結(jié)合在一起引起立體結(jié)構(gòu)上的變化，才具有生物活性。一般認(rèn)為，α-亞基負(fù)責(zé)信號(hào)傳導(dǎo)作用，β-亞基是功能亞基，參與受體結(jié)合。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，α-亞基和β-亞基均參加受體結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)作用。它對(duì)雌性動(dòng)物卵泡生長(zhǎng)發(fā)育尤其對(duì)竇狀卵泡發(fā)育成熟起著至關(guān)重要的作用。促卵泡激素可在絕經(jīng)期女性的尿液中提取得到，也可以通過基因工程的方法重組表達(dá)得到。臨床主要用于對(duì)不孕癥患者的治療，用以刺激卵泡的發(fā)育成熟，同時(shí)也用于體外人工受精和體內(nèi)人工受精的相關(guān)治療中。

太湖豬高產(chǎn)仔數(shù)的物質(zhì)基礎(chǔ)是高的排卵率和良好的子宮容量。而在卵泡發(fā)育和排卵過程中，F(xiàn)SH和LH是兩種起直接作用的糖蛋白激素，其中FSH應(yīng)用于超排的研究已證明高濃度的FSH可以促進(jìn)更多的卵泡成熟，在LH協(xié)同作用下，實(shí)現(xiàn)超排。近年來，在鼠、羊、牛等許多動(dòng)物中，對(duì)抑制素免疫所引起的排卵率的變化最終也歸因于FSH濃度的上升。研究發(fā)現(xiàn)首次發(fā)情周期內(nèi)，太湖豬循環(huán)血液中FSH濃度顯著高于其它豬種。因此，F(xiàn)SH被當(dāng)作控制太湖豬高排卵率的候選基因。陳杰等采用PCR-SSCP作為遺傳標(biāo)記，對(duì)二花臉豬FSHβ-亞基基因位點(diǎn)和產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)系進(jìn)行了研究，他們發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記位點(diǎn)與二花臉豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀顯著相關(guān)，PCR-SSCP標(biāo)記基因型的不同可以導(dǎo)致豬的產(chǎn)仔數(shù)有顯著差異。

我國(guó)是世界第一養(yǎng)豬大國(guó)，無論從經(jīng)濟(jì)方面考慮還是從環(huán)境方面考慮，在保證需求的同時(shí)，減少母豬的飼養(yǎng)量，提高母豬的繁殖性能，具有重要的理論和實(shí)踐意義。如何提高母豬繁殖能力一直是困擾畜牧工作者的一個(gè)難題。母豬的年生產(chǎn)力主要由產(chǎn)仔數(shù)、仔豬存活率及產(chǎn)仔間隔所決定。但繁殖性狀的遺傳力低、性狀表現(xiàn)晚、而且是限性遺傳，受環(huán)境因素影響很大，所以在過去，通過常規(guī)育種手段進(jìn)行選育取得了一些進(jìn)展，但進(jìn)展緩慢，至今停滯不前，達(dá)到所謂的“選擇高原”。據(jù)報(bào)道，法國(guó)用30多年的時(shí)間來改良豬產(chǎn)仔數(shù)性狀，但進(jìn)展甚微；丹麥將產(chǎn)仔數(shù)提高1頭用了50多年。

因此，有必要利用最新的分子生物學(xué)技術(shù)，從基因水平著手，獲得繁殖力高的轉(zhuǎn)基因豬。以后在豬中與生殖及其產(chǎn)仔數(shù)的功能研究和未來轉(zhuǎn)基因育種打下重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于通過構(gòu)建二花臉豬基因組BAC文庫(kù)，篩選獲得豬促卵胞激素α-亞基的編碼基因FSHα，從而將該基因應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因克隆豬的構(gòu)建提高母豬產(chǎn)仔數(shù)。

本發(fā)明提供了一種豬促卵胞激素α-亞基的編碼基因FSHα，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

本發(fā)明提供了一種基因FSHα的篩選方法，所述方法包括以下步驟：

(1)構(gòu)建二花臉豬基因組BAC文庫(kù)：采二花臉公豬靜脈血制備核DNA，酶切后獲得核DNA片段；將所述核DNA片段與載體連接后點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌獲得二花臉豬基因組BAC文庫(kù)；

(2)從所述BAC文庫(kù)中篩選獲得包含SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列的BAC克隆；

利用篩選引物對(duì)二花臉豬基因組BAC文庫(kù)超級(jí)池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出陽(yáng)性克隆作為BAC文庫(kù)二級(jí)池；再次利用所述篩選引物對(duì)BAC文庫(kù)二級(jí)池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出含有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列的BAC克隆；

其中所述篩選引物為：

pFSHα249-UP:GCCCAGAATGCAAGCTAAAG(SEQ?ID?NO：2所示的序列)。

pFSHα249-DOWN:GATGTGCTCTGGGGACATTT(SEQ?ID?NO：3所示的序列)。

可選的，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：