[發(fā)明專利]一種熱穩(wěn)定性及比酶活提高的堿性α-淀粉酶突變體在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410852880.5 | 申請(qǐng)日： | 2014-12-31 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN104498453A | 公開（公告）日： | 2015-04-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張桂敏;盧爭(zhēng)輝;馬延和 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 湖北大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N9/28 | 分類號(hào)： | C12N9/28;C12N15/10;C12N15/70 |
| 代理公司： | 武漢河山金堂專利事務(wù)所42212 | 代理人： | 丁齊旭 |
| 地址： | 430016湖北*** | 國(guó)省代碼： | 湖北;42 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 熱穩(wěn)定性 提高 堿性 淀粉酶 突變體 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性及比酶活提高的堿性α-淀粉酶突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
α-淀粉酶(EC?3.2.1.1)屬于糖苷水解酶13家族(GH13)，能催化水解淀粉及相關(guān)多聚物內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，分布于植物、動(dòng)物及微生物中。α-淀粉酶因能水解淀粉及相關(guān)多聚物產(chǎn)生α異頭物的單糖或寡糖，或通過轉(zhuǎn)糖苷作用形成α糖苷鍵，是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并且是迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的商品化酶，占全球酶制劑市場(chǎng)份額的25％～33％，尤其是酸性淀粉酶已廣泛應(yīng)用于淀粉原料液化、青貯飼料、白酒釀造、烘焙等工業(yè)化生產(chǎn)中。此外，在堿性溶液中表現(xiàn)出最佳活性的堿性α-淀粉酶可應(yīng)用于造紙和紙漿工業(yè)中的淀粉改性，以及作為洗滌添加劑去除淀粉類污漬，作用日益突出。
由于在高溫下反應(yīng)具有減少微生物污染、增加底物溶解度及降低粘度等優(yōu)點(diǎn)，工業(yè)生產(chǎn)過程一般要求在高溫下進(jìn)行。同時(shí)，比酶活較高的酶轉(zhuǎn)化等量底物或產(chǎn)生等量產(chǎn)物所需要的酶更少，時(shí)間更短。
來自于Bacillus?pseudofirmus?703的堿性α-淀粉酶Amy703(氨基酸序列的GenBank登錄號(hào)為AGT54942)，其在pH?9.0，40℃時(shí)具有最高酶活，在堿性pH(8.0～10.5)條件下穩(wěn)定，在50℃處理20min后，殘余酶活為18.5％，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)、Ni柱純化后的比酶活為4.93U/mg。但堿性α-淀粉酶Amy703的比酶活與熱穩(wěn)定性還需進(jìn)一步提高，以滿足工業(yè)生產(chǎn)提高效率節(jié)約能源的要求。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用基因技術(shù)改造GenBank登錄號(hào)為AGT54942的堿性α-淀粉酶，提高其比酶活、熱穩(wěn)定性，進(jìn)一步適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的更高要求。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。在GenBank登錄號(hào)為KF451925.1的堿性α-淀粉酶基因Amy703，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列收錄號(hào)為AGT54942的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物(FP和RP)進(jìn)行PCR，獲得缺失N端669個(gè)核苷酸的α-淀粉酶突變體基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；
所述引物為：FP:5’CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC?3’
RP:5’CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC?3’。
本發(fā)明的重組堿性α-淀粉酶Amy703的構(gòu)建方法，具體包括如下步驟：
1)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆得到GenBank登錄號(hào)為KF451925.1的堿性α-淀粉酶基因Amy703。
2)將Amy703基因片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a上，得到重組載體pET28a-Amy703；
3)設(shè)計(jì)缺失Amy703基因N端669個(gè)核苷酸的突變引物FP和RP，以重組載體pET28a-Amy703為模板，進(jìn)行PCR；
FP:5’CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC?3’
RP:5’CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC?3’
PCR反應(yīng)體系：10×Ex?Taq?buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，5μl；突變引物FP(10μM)，2μl；突變引物RP(10μM)，2μl；Ex?Taq，0.3μl；模板，1μl；加ddH2O至50μl。
空白對(duì)照：將以上體系中的DNA模板換成ddH2O，其他不變。
PCR擴(kuò)增體系：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，2min?15s，25個(gè)循環(huán)；72℃，7min；12℃，∞；
4)將步驟3)獲得的PCR產(chǎn)物用0.7％的瓊脂糖凝膠回收后，連接T載體pMD18-T，通過測(cè)序驗(yàn)證，得到堿性α-淀粉酶突變體基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于湖北大學(xué);，未經(jīng)湖北大學(xué);許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購(gòu)買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請(qǐng)聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201410852880.5/2.html，轉(zhuǎn)載請(qǐng)聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
