[發(fā)明專利]一種基因工程菌及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410852712.6
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104593279A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁紅莉;朱寧;楊金水
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/53;C12P19/14;C12P19/02;C12R1/865;C12R1/84;C12R1/78
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種基因工程菌，包括宿主細胞和轉(zhuǎn)入宿主細胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因為黃孢原毛平革菌溶解性多糖單加氧酶的編碼基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主細胞為釀酒酵母、漢森酵母或畢赤酵母；優(yōu)選為畢赤酵母；更優(yōu)選的，所述宿主細胞為畢赤酵母GS115。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌內(nèi)含有重組載體pPIC9K/Pc10320的核苷酸片段，所述Pc10320為SEQ?ID?NO.2所示的序列。

4.權(quán)利要求1-3中所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

重組載體構(gòu)建：以黃孢原毛平革菌的基因組cDNA為模板，利用SEQ?ID?NO：3所示的序列為上游引物，SEQ?ID?NO：4所示的序列為下游引物通過PCR反應(yīng)獲得PCR產(chǎn)物，再用SnaB?I和Avr?II對PCR產(chǎn)物和pPIC9K載體進行雙酶切后連接獲得重組載體pPIC9K/Pc10320；

重組載體的轉(zhuǎn)化：利用大腸桿菌感受態(tài)細胞擴增所述重組表達載體并收集擴增產(chǎn)物，將所述擴增產(chǎn)物用SacⅠ進行酶切后轉(zhuǎn)化宿主細胞獲得基因工程菌。

5.權(quán)利要求1-3中所述的基因工程菌或者根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法構(gòu)建獲得的基因工程菌在纖維素類原料降解中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括微晶纖維素降解和農(nóng)作物秸稈降解。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

將所述基因工程菌接種至培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀為2-6，加入誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)表達，分離純化獲得溶解性多糖單加氧酶10320，與纖維素酶混合后降解微晶纖維素或農(nóng)作物秸稈。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)基的組成成分為：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH6.0的磷酸鉀l00mM、YNB13.4g/L、生物素4×10⁶g/L、甘油l0g/L。

9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任意一項所述的應(yīng)用，其特征在于，誘導(dǎo)表達的條件為：在25-28℃，150-180rpm下培養(yǎng)，向培養(yǎng)基中添加100％甲醇至終濃度為1.0％；繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時添加甲醇至終濃度為1.0％，誘導(dǎo)72h后獲得發(fā)酵液上清。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，相對于100g的所述纖維素類原料，所述溶解性多糖單加氧酶10320的添加量為0.1-1g，纖維素酶的添加量為5-15g。