[發明專利]胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶

在審

• 申請號: 201410850778.1
• 申請日: 2014-12-30
• 公開（公告）號: CN104611305A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 姚冬生;邱玉信;謝春芳;劉大嶺
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/645;C12R1/84
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉宇峰

技術領域

本發明涉及黃曲霉毒素解毒酶，特別涉及到對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶。

背景技術

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的劇毒性次生代謝產物，已經確定的黃曲霉毒素分子的結構主要有八種，分別是AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2，AFGM1，AFGM2，其中毒性最強的黃曲霉毒素B1被認為是潛在的對人類危害極為突出的一類強致癌誘變劑，一次大量攝入黃曲霉毒素B1會引起人及動物的急性中毒、甚至死亡；小劑量長期攝入會致畸、致突變和致癌，即使幾十ppb的含量仍有極大的毒性；黃曲霉毒素廣泛存在于谷物、糧食和飼料原料中，畜禽攝入污染了黃曲霉毒素的飼料會引起動物體重下降或引發疾病，通過食物鏈間接進入人體的黃曲霉毒素具有極強的致癌作用，嚴重威脅人類健康。因此，解決黃曲霉毒素對飼料糧食的污染及對動物生產和人類健康的危害有非常重要的意義；

由于黃曲霉毒素的熱穩定性好、耐高溫，飼料中含有的毒素絕大部分是隨著動物對其消化在消化道內分解過程逐步釋放出來，化學去毒方法通常不具備在飼料中應用價值；傳統的物理吸附方法存在特異性差，應用效果促在爭議的問題。生物酶解黃曲霉毒素具有特異性好，分解效果切確等優點。利用黃曲霉毒素解毒酶對AFB1進行降解具有以上優點，黃曲霉毒素解毒酶(Aflatoxin?Detoxinfizyme，ADTZ)是一種在體外能夠使一族黃曲霉毒素結構雙呋喃環中的呋喃雙鍵斷裂，將黃曲霉毒素轉化成無毒產物的酶。

目前，飼料添加劑用酶的使用都是通過添加在飼料中一起喂食動物，經胃到達腸道，在腸道中發揮酶的作用。在這個過程中，飼用酶會受到動物腸道消化酶不同程度的破壞，而降低了使用效率，因此，提高飼料用酶對消化酶，如胰蛋白酶的耐受性，可以延長其在動物體內消化道的使用壽命，對飼用酶的應用十分有價值。

本發明利用酶促反應理論和蛋白分子之間相互識別的原理，以及計算化學的方法，設計并篩選到了一株黃曲霉毒素解毒酶突變體，所獲得的黃曲霉毒素解毒酶突變體對AFBI催化降解功能不受影響，而對胰蛋白酶的耐受提高了，該突變株對胰蛋白酶抗性比野生型提高了2.73倍，命名為ADTZ^{K213C/K244C/K270S}。

發明內容

本發明的首要目的是提供一種對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶。

本發明是對黃曲霉毒素解毒酶的基因(稱為ADTZ基因)進行定點突變。由假密環菌(Armillariellatabescens)AS165中獲得的黃曲霉毒素解毒酶，已經被測序，GENBANK登錄號為AY941095。該酶的成熟蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1。

根據本發明所述的一種定點突變改造的黃曲霉毒素解毒酶，是由氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1的來源于假密環菌(Armillariellatabescens)的黃曲霉毒素解毒酶中制造多個氨基酸取代而產生的，對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶，所述的氨基酸取代是第213、244和270位的取代。

根據本發明所述的定點突變改造的黃曲霉毒素解毒酶的進一步特征，所述在第213位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代賴氨酸；在244位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代賴氨酸；在第270位的氨基酸取代是用絲氨酸取代賴氨酸；所述的定點突變改造的黃曲霉毒素解毒酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2。

本發明所述的作用于黃曲霉毒素的突變體黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ^{K213C/K244C/K270S})，經人工腸液(pH6.0，1mg/mL胰蛋白酶溶液)處理10min后，其對胰蛋白酶的抗性比野生型ADTZ提高2.73倍，經人工腸液(pH6.0，1mg/mL胰蛋白酶溶液)處理180min后，其半衰期比野生型酶延長了72分鐘，其他酶學性質與野生型酶基本一致。

進一步地，本發明提供了一種DNA分子，其編碼本發明所述的對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶。

優選地，本發明所述的DNA分子的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.3。

本發明的另一個目的是提供一種載體，其含有本發明所述的DNA分子。

本發明的又一個目的是提供一種宿主細胞，其含有本發明所述的DNA分子，或者含有本發明所述的載體。

上述載體和宿主細胞都可以通過本領域公知的技術手段進行制備。