[發明專利]一種軟骨細胞培養基及軟骨細胞培養方法

有效

• 申請號: 201410842786.1
• 申請日: 2014-12-30
• 公開（公告）號: CN104480066B
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 邱彩娥;田智泉;朱君;郭靜
• 申請（專利權）人: 陜西瑞盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京中博世達專利商標代理有限公司11274
• 代理人: 申健

技術領域

本發明涉及軟骨細胞培養領域，尤其涉及一種軟骨細胞培養基及軟骨細胞培養方法。

背景技術

關節軟骨主要是由軟骨細胞和細胞外基質組成的無血管組織，主要依靠關節的運動和擠壓吸收營養物質，所以軟骨損傷后自我修復能力比較弱，其損傷后的修復移植一直以來是醫學界的難題之一。近年來，隨著組織工程技術的發展，自體軟骨移植在軟骨損傷的臨床治療在國內外都有應用。臨床研究對患者組織取材有限，并且也因為軟骨細胞是終末分化細胞，體外增殖能力有限且易去分化，所以對體外軟骨細胞的培養和擴增成為目前要解決的關鍵。

為了對體外軟骨細胞進行培養和擴增，出現了多種培養軟骨細胞的軟骨細胞培養基。例如，現有技術提供的一種傳統軟骨細胞培養基的配方為：培養基+10％自體血清+60μg/ml Vc。

但是，發明人發現，利用該軟骨細胞培養基在培養軟骨細胞的過程中，軟骨細胞去分化趨勢嚴重，軟骨細胞的增殖能力差，極大的限制了軟骨細胞的應用。

發明內容

本發明的主要目的在于，提供一種軟骨細胞培養基及軟骨細胞培養方法，能夠降低軟骨細胞的去分化，提高軟骨細胞的增殖能力。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

第一方面，本發明實施例提供一種軟骨細胞培養基，包括：基礎培養基、濃度為5-20％的血清、濃度為1-20ng/ml的血小板源性生長因子和濃度為(1-5)*10-5M/Lβ-巰基乙醇。

優選的，所述軟骨細胞培養基還包括濃度為1-15 ng/ml的骨形成蛋白BMP-2或者其類似物。

優選的，所述軟骨細胞培養基還包括濃度為5-100ng/ml的堿性成纖維生長因子bFGF和濃度為3-30ng/ml的轉化生長因子TGF-β。

優選的，所述軟骨細胞培養基還包括濃度為20-200μg/ml的維生素C。

優選的，所述軟骨細胞培養基還包括濃度為2-20μg/ml的胰島素和濃度為1-20ng/ml的胰島素生長因子IGF-1。

優選的，所述血清為胎牛血清或者自體血清。

優選的，所述軟骨細胞培養基還包括濃度為(0.5-5)*10-6M/L的地塞米松。

優選的，所述軟骨細胞培養基還包括濃度為1％的丙酮酸鈉和2-20ng/ml的白細胞介素(IL-1)。

優選的，所述基礎培養基為DMEM或者DF12。

另一方面，本發明實施例提供一種軟骨細胞培養方法，通過使用第一方面所述的軟骨細胞培養基，培養預先制備的原代人軟骨細胞，獲取傳代3-5次的軟骨細胞。

優選的，軟骨細胞的培養方法還包括：制備原代人軟骨細胞，具體為：

將人關節軟骨組織用0.05-1％II型膠原酶消化；

將完成消化的細胞用培養液稀釋后，離心收集細胞；

用培養液離心洗滌，獲取原代人軟骨細胞。

本發明實施例提供的一種軟骨細胞培養基包括：基礎培養基、濃度為5-20％的血清、濃度為1-20ng/ml的血小板源性生長因子和濃度為(1-5)*10-5M/Lβ-巰基乙醇。該軟骨細胞培養基用于培養軟骨細胞，能夠改善軟骨細胞的培養狀態，降低軟骨細胞去分化趨勢，提高軟骨細胞的增殖能力。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。

圖1-a為使用相應的A-G培養基培養的軟骨細胞傳代一次的光學顯微照片；

圖1-b為使用相應的A-G培養基培養的軟骨細胞傳代兩次的光學顯微照片；

圖1-c為使用相應的A-G培養基培養的軟骨細胞傳代三次的光學顯微照片；

圖2為對軟骨細胞培養基A-G培養的第三代細胞進行甲苯胺藍染色的光學顯微照片；

圖3為對軟骨細胞培養基A-G培養的第三代細胞進行Ⅱ型膠原免疫組化分析的光學顯微照片。

具體實施方式