[發(fā)明專利]一種檢測水體類金屬砷的微生物學(xué)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410842289.1
• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN104911200B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂建新;紀松軍;周懷彬;杜璟;鄭美琴
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/689;C12Q1/02;C12R1/19
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1.一株大腸埃希氏菌WMC-011p的應(yīng)用，其特征在于所述大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)WMC-011p CGMCC No.9760應(yīng)用于水體類金屬砷的檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株大腸埃希氏菌WMC-011p的應(yīng)用，其特征在于大腸埃希氏菌WMC-011p構(gòu)建方法，包含以下步驟：(1)采用Red重組系統(tǒng)敲除賦予野生型大腸埃希氏菌MC4100砷抗性的arsB基因；

(2)設(shè)計araB基因N末端和C末端的內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物以及pars-arsR-gfpmut2基因的引物，采用交叉PCR技術(shù)構(gòu)建含有報告基因pars-arsR-gfpmut2與araB基因的兩端同源臂的融合PCR片段；

(3)將步驟(2)所得片段克隆到pMD18-T載體上，構(gòu)建pars-arsR：：gfpmut2-T重組載體；

(4)測序分析正確的重組載體pars-arsR：：gfpmut2-T經(jīng)雙酶切切下目的條帶連接到pKOV載體上，構(gòu)建融合報告載體pKOV-ars-arsR：：gfipmut2；

(5)將所述重組載體pKOV-ars-arsR：：gfpmut2轉(zhuǎn)入到步驟(1)所得的大腸埃希氏菌菌株中，通過兩次同源重組，將ars-arsR：：gfpmut2報告基因置換到步驟(1)所得的大腸埃希氏菌ΔarsB菌株基因組中的araB編碼基因位置。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株大腸埃希氏菌WMC-011p的應(yīng)用，其特征在于大腸埃希氏菌WMC-011p菌株檢測水體中類金屬砷的標準化流程為：(1)取5-10μl E.coli WMC-011p凍存菌液接種于5ml LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，過夜培養(yǎng)；

(2)取步驟(1)中1％體積過夜菌種子液加入到含有終濃度為40mM MOPS緩沖成分的LB培養(yǎng)基中；

(3)將步驟(2)中菌液37℃，250rpm，培養(yǎng)至OD600值為0.4-0.6范圍，加入不同濃度的As³⁺或者pH值范圍為0.48-13.74的待檢測水樣，37℃、250rpm振蕩孵育2-8h；

(4)待測菌株樣品處理：將步驟(3)中菌液4000rpm，水平離心10min，棄上清，收獲的菌體重懸于1ml DB緩沖液中，其中含有20μg/ml氯霉素用于阻止新的GFP蛋白的合成，然后將重懸菌液稀釋0-20倍，為了使背景散射和內(nèi)濾效應(yīng)最小化，需要E.coli WMC-011p全細胞懸浮液的OD600≤0.3；

(5)用分光光度計測步驟(4)中處理后樣品OD600值，熒光分光光度計測其熒光值；

(6)在10^-7-10^-4mol/L的As³⁺濃度范圍內(nèi)，E.coli WMC-011p菌株中GFPmut2的表達量和熒光強度都與As³⁺濃度呈劑量依賴關(guān)系；根據(jù)同批次已知濃度的砷離子標準溶液誘導(dǎo)制作綠色熒光強度標準曲線及其方程，數(shù)據(jù)處理，將測得的未知環(huán)境水體樣品熒光強度值代入方程，計算得到未知環(huán)境水體樣品中砷的濃度。