[發明專利]一種檢測水體重金屬鉛的微生物學方法

有效

• 申請號: 201410842214.3
• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN104946682B
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 呂建新;嚴錫娟;葉薇;李江輝
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/689;C12Q1/02;C12R1/19
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1.一株大腸埃希氏菌WMC-008p的應用，其特征在于所述大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)WMC-008p CGMCC No.9748應用于水體重金屬鉛的檢測。

2.根據權利要求1所述的一株大腸埃希氏菌WMC-008p的應用，其特征在于所述的大腸埃希氏菌WMC-008p工程菌株的構建方法如下：

2.1權利要求1所述的大腸埃希菌工程菌株，其特征在于，利用Red重組酶系統中條件復制質粒pKD46和pCP20，敲除野生型大腸埃希菌E.coli MC4100基因組中zntA和zntR兩個基因，構建ΔzntAΔzntR雙基因突變菌株；

2.2一種鉛離子誘導的紅色熒光蛋白報告元件，其特征在于，是一個由轉錄調節蛋白PbrR基因及其啟動子PpbrA和該啟動子與紅色熒光蛋白DsRed-express2的融合片段相連接構建的表達元件，定位于大腸埃希菌的基因組；包括以下步驟：

2.2.1利用交叉PCR技術實現將人工合成pbrR基因及其啟動子PpbrA片段和紅色熒光基因DsRed-express2與PbrA基因啟動子PpbrA相融合的融合報告基因PpbrA：：DsRed-express2片段相連接，形成最終片段PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2；

2.2.2將步驟2.2.1所得片段克隆到pMDTM19-T載體上，構建PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-T重組載體；

2.2.3測序分析正確的重組載體PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-T經sal I和NotI雙酶切后的目的條帶連接到pKOV載體上，構建打靶載體PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-pKOV；

2.2.4將步驟2.2.3所得打靶載體轉入ΔzntAΔzntR雙基因敲除菌株，打靶載體pKOV使PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2成功替換ΔzntAΔzntR雙基因敲除菌株基因組上zntA基因位置。

3.根據權利要求1所述的一株大腸埃希氏菌WMC-008p的應用，其特征在于所述大腸埃希氏菌WMC-008p檢測水體中重金屬鉛的微生物方法，包含以下步驟：

3.1培養基的配制：

1g/L胰蛋白胨、0.5g/L酵母膏、1g/L NaCl，先加50ml MilliQ H2O，振蕩至完全融解后加MilliQ H2O定容至80ml，高壓蒸汽滅菌，再加入10ml 400mM無菌MOPS緩沖液，混勻；

3.2標準曲線的制定：

把鉛單元素標準品用無菌MilliQ級的純水稀釋成適當的濃度梯度；

3.2.1從步驟2.2.4獲得的甘油保存菌E.coli WMC-008p菌株中取5-10μl接入步驟3.1配制的新鮮5ml LB培養基，37℃，250rpm過夜培養；

3.2.2取5-10μl步驟3.2.1的E.coli WMC-008p過夜菌加入到LB培養基中，37℃，250rpm，恒溫震蕩培養至OD600值在0.5-0.6，取90-900μl菌液分裝至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm規格的檢測管內，同時在每個檢測孔或檢測管內加入鉛離子使終濃度分別為0.05、0.25、0.50、1.00、5.00、7.50、10.00、12.50、15.00μmol/L，37℃、250rpm振蕩孵育3-5h；

3.2.3將步驟3.2.2菌液4,000rpm，水平離心10min，棄上清，收獲的菌體重懸于1ml含500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20μg/ml氯霉素、pH 8.0DB緩沖液中，制成菌懸液；

3.2.4將步驟3.2.3重懸菌液稀釋20倍，使E.coli WMC-008p全細胞懸浮液的OD600≤0.2，混勻，分別測量其稀釋液熒光值，激發波長為550nm，發射波長為570nm，并測其OD600值；

3.2.5數據處理：相對熒光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFUM＝FM/OD600M，FM為與鉛單元素標準品孵育E.coli WMC-008p菌懸液的熒光值，OD600M為與鉛單元素標準品孵育E.coli WMC-008p菌懸液的吸光度；RFUW＝FW/OD600W，FW為與MilliQ級純水孵育E.coli WMC-008p菌懸液的背景熒光值，OD600W為與MilliQ級純水孵育E.coli WMC-008p菌懸液的吸光度；絕對熒光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFUM-RFUW，RFUM為與鉛單元素標準品孵育E.coli WMC-008p菌懸液的相對熒光值，RFUW為與MilliQ級純水孵育E.coli WMC-008p菌懸液的相對背景熒光值；

3.3樣品檢測：用移液槍吸取E.coli WMC-008p CGMCC No.9748過夜菌種子液加入到含有終濃度為40mM MOPS緩沖成分的LB培養基中，使起始菌液OD600值為0.5-0.6，分裝至15×150mm規格的無菌試管或康寧公司的96孔透明底黑色微孔板中，并在開始接菌時即加入1/1000-1/100體積不同濃度的pb2+溶液或待檢測環境水體樣品，另加等體積無菌MilliQ H2O作為陰性對照，每種濃度或樣品各做3個平行管或3個平行孔，37℃、250rpm振蕩孵育3h，4,000rpm，水平離心10min，棄上清，收獲的菌體重懸于1ml DB中，然后將重懸菌液稀釋20倍，混勻，分別測量其稀釋液在激發波長為550nm，發射波長為570nm條件下的熒光值與OD600值；然后將測得的未知環境水體樣品熒光強度值代入上述步驟3.2所得方程，計算得到未知環境水體樣品中鉛的濃度。

4.權利要求1所述一株大腸埃希氏菌WMC-008p的應用，其特征在于大腸埃希氏菌WMC-008p檢測菌株在檢測環境水體中重金屬鉛的應用：在含有40mM MOPS緩沖成分的LB培養基中，E.coli WMC-008p菌株對水體樣品的pH值具有較強的抗干擾能力，并能應用于環境水體樣品中鉛離子的檢測；相對于原子吸收光譜法，E.coli WMC-008p菌株對pH值范圍為1.5-12.9的水體樣品中pb2+的加標回收率為91％-109％，對溫州醫科大學附近工業廢水樣品中pb2+的加標回收率為87％-116％。