[發明專利]一種便于蛋白質譜高效分析表達量差異蛋白的蛋白提取和電泳方法

有效

• 申請號: 201410840382.9
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104483421A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 薛棟升
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 常海濤

技術領域

本發明屬于蛋白質譜工程領域，具體涉及一種便于蛋白質譜高效分析表達量差異蛋白的蛋白提取和電泳方法。

背景技術

纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產生的纖維素達到100億噸左右，利用纖維素生產生物能源，是緩解能源危機，實現人類可持續發展的關鍵。

纖維素利用的關鍵是把纖維素降解為可發酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中內切酶降解長片段的纖維素成為二聚體，是纖維素降解的關鍵步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色，條件溫和，轉化率高的特點，但是纖維素較高的生產成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。

獲得高產纖維素酶的菌株，降低纖維素酶的生產成本成為纖維素酶工業化利用的必由之路。纖維素酶的生產菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其較高的安全性，被認為是生產纖維素酶最有應用前景的菌株之一。構建黑曲霉高產菌種成為降低纖維素酶生產成本的最有效途徑之一。現在基因工程技術構建纖維素酶生產菌種一般通過基因敲除某個基因或增強某個基因的表達。這些手段構建的基因工程菌種雖然產量有一定提高，但是產量提高有限。原因基因工程敲除或強化表達的基因相對單一，纖維素酶產量的提高僅僅靠強化幾個基因的表達，產量提高有限。要進一步提高基因工程菌種，就需要在已有的操作目的基因以外進行改造。

黑曲霉在誘導環境下下產生纖維素酶，基于二維電泳技術的技術能標識在兩種誘導劑誘導下胞外蛋白表達差異的種類，測定有差異蛋白的氨基酸序列，從而對表達有差異的蛋白進行鑒定。這些差異蛋白的鑒定，能為基因工程技術的改造提供新的操作對象，為基因工程菌株的構建提供一個新的改造目標基因。

黑曲霉由于胞壁堅韌，菌絲較長，必須有高效的破壁技術破除細胞壁，而且在細胞壁破除時不破壞蛋白質的肽鏈。已有的蛋白破壁方法如：研磨破碎要破碎霉菌的細胞壁，所需的巨大剪切力對菌體的蛋白損傷較大，而且破壁性能較差，因此很能使用與精確定量和定性分析的目的；超聲波破碎效果非常差，不適宜霉菌；用均漿機破碎時，具有破壁力大，蛋白損傷或損失小的特點，但是由于霉菌的韌性較大，因此很難高效破碎，因此需要一定能增加脆性的方法，使霉菌用均漿機破碎更高效。用低溫冷凍液增加霉菌脆性，是一個新的有效的提高破壁效率和蛋白提取率的方法。

同時由于黑曲霉的蛋白組成，不同于細菌、酵母菌，而且也顯著不同于其他霉菌。黑曲霉的蛋白種類繁多，而且一些蛋白的理化性質較為接近，已有的蛋白電泳技術不能非常充分的分開黑曲霉的蛋白。因此必須有更高效的電泳方法來充分的分離各個蛋白質點。

同時在電泳時必須盡可能的把各個蛋白質點展開，這樣才能高效的分析蛋白在表達量和表達種類的差異。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于破碎細胞壁的低溫破壁液，該破壁液能夠能增加蛋白的提取率。本發明的目的還在于提供一種蛋白三向電泳方法。本發明的破壁液與電泳方法能高效的提取黑曲霉的蛋白并充分分離各個蛋白質點。

一種用于破碎細胞壁的低溫破壁液，其配制為：無水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0.02g，十二烷基硫酸鈉0.03g，蒸餾水定容至1L；使用前在-20℃預冷24h以上。

一種蛋白三向電泳方法，包括如下步驟：

(1)制備蛋白電泳膠體：把塑料條用蒸餾水涂濕，放置在距制備膠體的盒子底部靠近一端的位置，然后向盒子里面澆注SDS-PAGE膠體液至液體的高度達到1-2cm時候停止澆注，放置一張醋酸纖維薄膜，繼續澆注，每升高1-2cm就放置一張醋酸纖維薄膜，直到液面達到5-10cm高，待膠體凝固后取下塑料條，得到一個放置IPG膠條的凹槽。

所述的SDS-PAGE膠體液優選為：50mL的配方：蒸餾水13.3mL，30％Acr-Bis(29:1)16.7mL，1M?Tris?pH8.819.0mL，10％SDS?0.5mL，10％過硫酸銨0.5mL。

(2)IPG膠條預處理：使用IPG干膠條在電泳平衡液I中浸泡24h以上。

所述的電泳平衡液I的配方優選為：50mmol/L?Tris-HCl，6mol/L尿素，30％甘油，40g/LSDS，痕量溴酚藍，使用前加入10g/L?DTT。

(3)第一向電泳：將樣品加入IPG膠條進行等電聚焦。