[發(fā)明專利]一種硝基還原酶的特異性熒光探針及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410836056.0
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104592984A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔京南;馮磊
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工常熟研究院有限公司
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07C205/46;C12Q1/26
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及硝基還原酶的特異性熒光探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

硝基還原酶家族屬黃素酶，通常含有黃素單核苷酸單元或黃素腺嘌呤二核苷酸單元，可以在輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸存在下代謝芳香族硝基化合物或者硝基取代的雜環(huán)化合物，根據(jù)對氧氣是否敏感以及電子轉(zhuǎn)移方式不同硝基還原酶可分為兩類：一類是氧氣不敏感型，這類硝基還原酶通過雙電子轉(zhuǎn)移方式在氧氣存在或缺氧條件下通過NADPH的作用均可將硝基化合物還原為亞硝基和羥胺中間體以及最終的氨基化合物；另一類是氧氣敏感型，這一類硝基還原酶只有在厭氧條件下才能還原硝基化合物，這是因為在氧氣存在下通過單電子還原硝基化合物得到的硝基陰離子自由基會直接與氧氣發(fā)生反應(yīng)生成超氧自由基，重新生成最開始的硝基化合物。

硝基還原酶通常存在于細(xì)菌如大腸桿菌中。研究表明缺氧組織或細(xì)胞以及腫瘤中硝基還原酶的含量相對正常狀態(tài)呈現(xiàn)升高趨勢。在缺氧條件下以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH作為電子供體細(xì)胞內(nèi)的硝基還原酶可催化多種外源硝基芳香族化合物發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移，生成硝基陰離子自由基，隨后進(jìn)一步被還原成羥胺或氨基。因此，硝基還原酶可以作為衡量細(xì)胞或生物體缺氧狀態(tài)的重要指標(biāo)。另一方面，硝基還原酶在藥物的激活和硝基芳香族化合物的生物降解中也起著重要作用，并在生物技術(shù)腫瘤治療抑制劑領(lǐng)域擁有良好的應(yīng)用前景。因此，測定生物體系中的硝基還原酶對進(jìn)一步了解其生物功能非常重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種硝基還原酶的特異性熒光探針及其應(yīng)用，該底物原型和水解產(chǎn)物的熒光屬性具有明顯差異，且產(chǎn)物更易檢測。利用該探針反應(yīng)可對多種生物體系中硝基還原酶的分布和功能進(jìn)行定量評價。

本發(fā)明提供了一種硝基還原酶的特異性熒光探針，該底物的硝基可以被硝基還原酶代謝為相應(yīng)的氨基化合物，產(chǎn)物顯示與底物不同的發(fā)射波譜；該底物是以苊醌為原料，通過硝化反應(yīng)得到的，其結(jié)構(gòu)通式如(1)所示。

本發(fā)明提供了硝基還原酶的特異性熒光探針的應(yīng)用，該底物作為硝基還原酶的特異性底物，發(fā)生還原反應(yīng)，通過定量檢測單位時間內(nèi)還原產(chǎn)物的生成量來測定酶或細(xì)胞制備液等生物樣品及細(xì)胞中硝基還原酶的活性。具體測定方法為：

——體系中以5-硝基苊醌作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/10～10K_m；單點測定時底物濃度優(yōu)選K_m。

——在PBS或Tris-HCl等常用緩沖液中，反應(yīng)溫度為20℃至60℃之間，優(yōu)選37℃為最優(yōu)反應(yīng)時間；孵育體系pH介于5.5～10.5之間，優(yōu)選pH?7.4為最優(yōu)反應(yīng)pH值；

——反應(yīng)時間為5～120分鐘，在確保以上底物相應(yīng)的水解產(chǎn)物達(dá)到定量限且底物轉(zhuǎn)化率不超過20％時終止反應(yīng)；

——測定單位時間內(nèi)水解產(chǎn)物生成量作為硝基還原酶活性的評價指標(biāo)。

本發(fā)明提供的硝基還原酶特異性熒光探針底物的應(yīng)用，所述底物消除率或水解產(chǎn)物的生成率應(yīng)介于0.1％～20％之間。

本發(fā)明提供的硝基還原酶特異性熒光探針底物的應(yīng)用，探針底物及其水解產(chǎn)物均具有熒光屬性，可采用熒光檢測器實現(xiàn)產(chǎn)物及底物的快速靈敏檢測；熒光檢測條件為：激發(fā)波長430nm，在460～660nm進(jìn)行熒光發(fā)射譜的檢測。此外，該特異性探針底物及相應(yīng)硝基還原酶活性檢測過程不會受生物體系基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾，可用于各種生物體系中硝基還原酶活性的定量測定。

該特異性探針反應(yīng)可用于重組羧酸酯酶、人及動物組織制備液及各類組織細(xì)胞中硝基還原酶活性的定量測定，還可用于快速篩選硝基還原酶的抑制劑及抑制能力的定量評價。

作為高特異性的硝基還原酶的熒光探針底物，該化合物可以用來檢測硝基還原酶的活性，尤其適合用于對細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞以及酵母菌克隆表達(dá)體系產(chǎn)生的硝基還原酶重組酶的酶活性測定，以及多種哺乳動物組織器官來源的組織微粒體、S-9等制備物中硝基還原酶的活性標(biāo)定。

本發(fā)明提供了一種5-硝基苊醌作為硝基還原酶熒光探針底物的應(yīng)用，其經(jīng)硝基還原酶代謝后可生成具有雙光子熒光屬性的代謝產(chǎn)物。該酶促反應(yīng)具有選擇性高、代謝產(chǎn)物易檢測、酶活性及抑制活性評價快速高效等特點。

選用本發(fā)明所述硝基還原酶的特異性探針底物檢測硝基還原酶體外活性具有以下突出優(yōu)勢：

(1)高特異性：5-硝基苊醌可被硝基還原酶高特異性地代謝成一個代謝產(chǎn)物，即硝基還原成氨基的產(chǎn)物。

(2)廉價易得：5-硝基苊醌及其代謝產(chǎn)物均可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡單易行。