[發明專利]一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶基因及其重組載體及應用

在審

• 申請號: 201410834370.5
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN105462994A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 李國高;李琦;劉朝陽;李望龍
• 申請（專利權）人: 湖南利爾康生物股份有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/08
• 代理公司: 北京方安思達知識產權代理有限公司 11472
• 代理人: 王宇楊;王敬波

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶基因及其重組載體和應用。

背景技術

過氧化氫酶(Catalase，簡稱CAT)，催化H₂O₂分解為H₂O和O₂。各種來源的CAT廣泛應用于食品消毒、醫學分析與診斷、紡織、造紙等工業領域。在紡織染整工藝中CAT主要用于去除織物漂白廢液中殘余的H₂O₂，消除其對后續染色工序的影響。與傳統化學工藝相比，CAT具有環境友好、面料后續印染質量高等優點；但值得注意的是，鑒于紡織印染工藝的特殊性，CAT的催化反應通常需在高溫(T>70℃)堿性(pH>9)環境中進行，這就需要CAT具備嗜熱嗜堿的應用特性。而目前文獻報道的嗜熱耐堿性CAT仍然較少。

CAT按蛋白三維晶體構象的結構特點可分為兩類：(1)催化中心含鐵卟啉環結構的CAT，稱鐵過氧化氫酶(FeCAT)；(2)催化中心由錳離子代替鐵離子卟啉結構，稱為錳過氧化氫酶(MnCAT)。近年來，研究者發現個別來源于高溫堿性環境中的細菌可以產生具有嗜熱嗜堿特性的MnCAT，例如：箱根生金球菌(Metallosphaerahakonensis)來源的MnCAT，在pH8.0-10.0環境中處理60min酶活損失小于20％；在70℃下處理50min，酶活殘留率約在60％；但目前Metallosphaerahakonensis來源的MnCAT在大腸桿菌中僅有少量的活性表達蛋白，且文獻^[1]中未表述具體的酶活值。

發明內容

本發明鑒于上述情況，根據大腸桿菌密碼子使用偏愛性，對Metallosphaerahakonensis來源的錳過氧化氫酶基因序列進行密碼子優化，提供一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶基因及其表達載體和重組菌株，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶的編碼基因，其序列如SEQIDNo.1所示：

所述編碼基因根據Metallosphaerahakonensis來源的錳過氧化氫酶基因核苷酸序列，按照大腸桿菌(Escherichiacoli)密碼子使用偏愛性(http://gcua.schoedl.de/seqoverall_v2.html)優化設計。所述Metallosphaerahakonensis來源的錳過氧化氫酶基因核苷酸序列選自GenBank數據庫。

本發明第二方面提供包含上述重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶基因的重組載體。優選的，所述重組載體使用的表達載體為pET系列表達載體。

更優選的，所述pET系列表達載體為pET24a(+)，獲得包含上述重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶基因的重組載體pET24a-MnCat。將本發明的重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選將本發明的重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶基因插入到質粒pET24a(+)上的NdeI和HindIII限制性酶切位點之間，得到重組表達載體pET24a-MnCAT，經測序驗證后保存在大腸桿菌DH5α中。

本發明第三方面提供包含上述嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶基因的重組菌株。

所述重組菌株由所述重組含錳過氧化氫酶表達載體pET24a-MnCAT轉化獲得。

優選的，所述重組菌株由所述重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶表達載體轉化大腸桿菌獲得。

更優選的，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)，獲得的重組菌株為大腸桿菌BL21(DE3)/pET24a-MnCAT。

本發明第四方面提供所述嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶MnCAT，由權利要求1所述的嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶基因編碼。

本發明第五方面提供所述嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶的制備方法，包括如下步驟：

1)用上述重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；

2)培養重組菌株，誘導重組嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶表達；

3)回收并純化所表達的嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶。

作為優選地，上述的重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶的制備方法，包括以下步驟：