[發明專利]焦磷酸測序法檢測EML4-ALK融合基因的引物對及試劑盒

在審

• 申請號: 201410828515.0
• 申請日: 2014-12-25
• 公開（公告）號: CN104911251A
• 公開（公告）日: 2015-09-16
• 發明（設計）人: 邵棠;陳慶
• 申請（專利權）人: 邵棠
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種焦磷酸測序法檢測EML4-ALK融合基因的引物對，包含所述引物對的試劑盒及該試劑盒的應用。

背景技術

棘皮動物微管相關類蛋白4(echinoderm?microtubule-associated?protein-like4，EML4)與間變性淋巴瘤激酶(anaplastic?lymphoma?kinase，ALK)融合基因與2007年被日本學者發現存在于部分非小細胞肺癌(NSCLC)患者中，EML4-ALK融合基因在NSCLC中的陽性率約為3％-4％左右。EML4-ALK融合基因包括多種變異體(variants)，其中變異體1(variant?1或V1)和變異體3(variant?3或V3)的檢出率最高。同時，EML4-ALK抑制劑為肺癌的個性化治療提供了新的途徑。

當前國內外廣泛使用的分子生物學檢測EML4-ALK融合基因的方法中，熒光原位雜交技術(FISH)操作復雜，而且不能區分不同的變異體；熒光定量PCR存在著檢測通量的局限性和假陽性的缺點，所以都還不能真正滿足臨床診斷檢測的需要。傳統的固相生物芯片(Biochip)或基因芯片技術存在著可重復性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點。

焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技術，具備同時對大量樣品進行測序分析的能力，為高通量、低成本、快速、直觀地進行核苷酸分析和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平臺。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的技術問題，本發明提出一種焦磷酸測序法檢測EML4-ALK融合基因的引物對以及含有所述引物對的試劑盒，可以同時檢測EML4-ALK?variant?1和EML4-ALK?variant?3兩種融合基因，具有高靈敏度、高特異性、高準確度、檢測迅速等優點。

技術方案：為實現上述技術目的，本發明提出了一種焦磷酸測序法檢測EML4-ALK融合基因的引物對，所述的EML4-ALK為EML4-ALK?variant?1和EML4-ALK?variant?3中的任意一種或兩種，其特征在于，所述引物對包括：

(1)對于EML4-ALK?variant?1基因，

擴增引物為：?

上游引物：5′-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3′，

下游引物：5′-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3′，

其中下游引物的5′端進行生物素標記；

測序引物為：?

5′-TGGGAAAGGACCTAAA-3′；

(2)對于EML4-ALK?variant?3基因：

擴增引物為：?

上游引物：5′-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3′，

下游引物：5′-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3′，

其中上游引物的5′端進行生物素標記；

測序引物：?

5′-GTGCTTCCGGCGGTA-3′。

本發明進一步提出了一種焦磷酸測序法檢測EML4-ALK融合基因的試劑盒，所述的EML4-ALK為EML4-ALK?variant?1和EML4-ALK?variant?3中的任意一種或兩種，其特征在于，所述試劑盒包含質控品和如下引物：

(1)對于EML4-ALK?variant?1基因，

擴增引物為：?

上游引物：5′-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3′，

下游引物：5′-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3′，

其中下游引物的5′端進行生物素標記；

測序引物為：?

5′-TGGGAAAGGACCTAAA-3′；

(2)對于EML4-ALK?variant?3基因：

擴增引物為：?

上游引物：5′-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3′，

下游引物：5′-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3′，

其中上游引物的5′端進行生物素標記；

測序引物：?

5′-GTGCTTCCGGCGGTA-3′。