[發(fā)明專利]一種用于表皮損傷修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410828141.2
• 申請日: 2014-12-26
• 公開（公告）號: CN104403998A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮樹梅;王瑋;譚周;賴成霞;李甜;白生賓;郭瓊;鐘近潔;秦紋
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆醫(yī)科大學(xué);馮樹梅
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61L27/38;A61L27/60
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于皮膚組織缺損修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞，通過脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)，構(gòu)建了含有確定基因的慢病毒載體，利用慢病毒將確定基因轉(zhuǎn)載至脂肪干細(xì)胞，通過慢病毒轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞，促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞向表皮分化，其特征在于，具體通過如下方法制備獲得：

（1）?脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)鑒定：無菌獲取人脂肪組織并進(jìn)行體外培養(yǎng)鑒定，以膠原酶振蕩消化后離心收集細(xì)胞，常規(guī)傳代及凍存,并對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長曲線及CD44、CD45、CD29、CD105表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞鑒定；

（2）脂肪干細(xì)胞的多向分化潛能鑒定：對所獲人脂肪干細(xì)胞分別進(jìn)行成脂和成骨分化鑒定，即分別以成脂和成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)細(xì)胞，2周后分別對成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行油紅染色和茜素紅染色的鑒定；

（3）?構(gòu)建含p63基因的慢病毒載體：從GeneBank?中查尋p63基因序列，設(shè)計(jì)引物，分別以attB1-Koza?k-TP63-F，attB2-flag-R為引物，進(jìn)行目的基因TP63的PCR?擴(kuò)增；再利用Gateway?Technology構(gòu)建pDown-?TP63-flag，最后利用Gateway?Technology構(gòu)建pLV.EX3d.P/neo-EF1A?>?TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒載體，通過菌落PCR篩選陽性克隆，挑取陽性克隆質(zhì)粒并測序；

（4）將上述制備的含p63基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到人脂肪干細(xì)胞：所獲得的pLV.EX3d.P/neo-EF1A?>?TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝，收集培養(yǎng)上清對病毒進(jìn)行熒光表達(dá)觀察及滴度測定；最后將Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti?-eGFP/Neo加入人脂肪干細(xì)胞，通過脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，并進(jìn)行PCR、WB和免疫熒光檢測；

（5）利用p63基因的作用促使脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化。

2.如權(quán)利要求1所述的一種用于皮膚組織缺損修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞，其特征在于，所述的用于皮膚組織缺損修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞通過如下具體方法制備獲得：

（1）?脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)鑒定：脂肪組織剪成糜狀，用PBS沖洗數(shù)遍，以0.1%膠原酶I置37℃搖床消化，離心30?min去上清，沉淀重懸于含10%?胎牛血清的DMEM?培養(yǎng)液中，移入培養(yǎng)皿中；隔天更換培養(yǎng)液；達(dá)到對數(shù)生長期后，用0.25%胰酶消化，按1：3的比例進(jìn)行傳代；

生長曲線的檢測：取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化，洗滌離心，制備單細(xì)胞懸液，接種到24?孔板中；每天隨機(jī)取4?孔細(xì)胞消化、記數(shù)，取其均值，連續(xù)7天，即可制備生長曲線；

流式檢測脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)記：流式細(xì)胞儀對第3代脂肪干細(xì)胞表面相對特異性抗原進(jìn)行檢測；0.?25%?胰蛋白酶消化細(xì)胞,?1500r?/分離心10?分鐘,?在細(xì)胞沉淀中細(xì)胞數(shù)量為1*?10⁶?，分別加入FITC-?CD105熒光抗體,?PE?-?CD29熒光抗體,FITC-CD45,FITE-CD44熒光抗體各20ul?,?4℃?孵育30分鐘,?再用PBS?緩沖液清洗2?遍,?最后用10%福爾馬林固定細(xì)胞,?上流式細(xì)胞儀測定抗原的陽性率；

（2）脂肪干細(xì)胞定向分化及鑒定：

成脂分化：細(xì)胞貼壁100%匯合后，加入間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液，成脂誘導(dǎo)72小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)，約2周后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細(xì)胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形，油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀；

成骨分化：取第3代細(xì)胞，加入間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)液加10?mol／L地塞米松、10?mmmol／Lβ一甘油磷酸鈉、50?mg／L抗壞血酸，誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后，細(xì)胞體積增大，呈短梭形；誘導(dǎo)第7天，細(xì)胞呈多角形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多；14天，胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長，細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積；29天，細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)；

（3）?構(gòu)建含p63基因的慢病毒載體：PCR擴(kuò)增attB1-Kozak-TP63-flag?-attB2，再利用Gateway?Technology構(gòu)建pDown-?TP63-flag，最后利用Gateway?Technology構(gòu)建pLV.EX3d.P/neo-EF1A?>?TP63/flag>IRES/eGFP?，挑取陽性克隆質(zhì)粒，送交陽性克隆測序；

（4）將上述制備的含p63基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到人脂肪干細(xì)胞：

病毒包裝：對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，DNA-?Lipofectamine????2000復(fù)合物添加到293FT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮；轉(zhuǎn)染后72小時(shí)再次收集濃縮；對病毒進(jìn)行熒光表達(dá)觀察及滴度測定；

細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)：待人脂肪干細(xì)胞完全貼壁后，選取兩孔細(xì)胞分別加入30μL的Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti?-eGFP/Neo，充分的搖勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)導(dǎo)6小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果；待細(xì)胞擴(kuò)增至足夠細(xì)胞量，然后將細(xì)胞傳代接種6孔板以及24孔板用于PCR、免疫熒光檢測；

（5）利用p63基因的作用促使脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化。