[發明專利]一種膠原蛋白酶高產海洋菌株

有效

• 申請號: 201410827010.2
• 申請日: 2014-12-25
• 公開（公告）號: CN104560803B
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 喬龍亮;朱鵬;黨晨陽;薛春旭;嚴小軍;李穎;宋燕燕
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/52;C12R1/01
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于功能微生物篩選技術領域，具體涉及一種膠原蛋白酶高產海洋菌株。

背景技術

中國是世界漁業生產大國、水產品出口大國和主要遠洋漁業國家，水產品總產量連續20年位居世界第1，世界水產養殖總產量的70％來自中國。近年來，僅魷魚年產量就達到12t以上。在魷魚的深加工中會產生15％-20％的內臟及表皮等廢棄物，不僅如此，在淡水魚的加工中，魚鱗和魚皮也被作為廢棄物扔掉。這些廢棄物具有很高的營養價值，含有大量的粗膠原蛋白，如果能充分利用這些漁業下腳料來提取膠原蛋白，不僅能促進漁業的進一步發展產生巨大的經濟效益，也能減少環境污染。

膠原蛋白是由3條肽鏈擰成的螺旋形蛋白質，廣泛存在于人體的皮膚、骨骼、肌腱和內臟等部位，具有極其重要的生理功能，并在醫療、美容、保健、食品等許多方面具有極其廣泛的應用。膠原蛋白的提取有多種方法，其中酶法在提取效率及安全性上都有明顯的優勢。膠原酶，即膠原蛋白水解酶，在其適合條件下能特異地降解膠原蛋白的三螺旋結構，且不損壞其活性肽結構。相比動物源膠原酶，微生物源膠原酶不只提取方便，而且具有更廣的應用范圍。許多土壤、皮毛、海水來源的微生物都能產生膠原酶，例如一些梭菌、弧菌和類菌體等。但對于來自于海洋微生物中的膠原蛋白酶的研究甚少。因此，有必要提供一種膠原蛋白酶的高產海洋菌株。

發明內容

本發明的目的是提供一種膠原蛋白酶高產海洋菌株，從而彌補現有技術的不足。

本發明的南極適冷菌NBUMB006(Rheinheimera sp.NBUMB006)，該菌株于2013年12月22日保藏在中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013682。

本發明的南極適冷菌NBUMB006用于發酵生產膠原蛋白酶；

本發明還提供一種膠原蛋白酶的生產方法，是將南極適冷菌NBUMB006接種于發酵培養基中進行發酵制備膠原蛋白酶；

所述的發酵培養基，其組成及配比為：明膠5g/L、酵母粉1g/L、檸檬酸鐵0.01g/L。

所述的培養基，其pH值為7.8。

本發明篩選分離得到一株高產膠原蛋白酶海洋菌株MB006,并基于16S序列進行分子系統進化分析，鑒定該菌株屬于Rheinheimera屬,隨后并采用響應面法對它的產酶條件進行了優化。首先通過單因素試驗，篩選出最適碳源為明膠，最適氮源為酵母粉。在此基礎上，采用Plackett-Burman試驗設計篩選出影響酶活的三個主效因子——明膠、裝液量和初始pH值。再通過最陡爬坡實驗逼近最大響應區域，用Box-Behnken試驗設計和嵴嶺分析確定主效因子的最優水平。優化后酶活可達65.64U/mL，為優化前的1.34倍。

具體實施方式

本發明從東海海域海水中篩選分離得到一產膠原蛋白酶產生菌株，通過響應面法對膠原蛋白酶產生菌MB006的液體發酵培養條件進行了優化，為下一步的工業化生產或分子育種提高膠原蛋白酶比活力奠定基礎。

本發明具體實施例中使用的大腸桿菌(Escherichia.coil)DH5α,購自TaKaRa公司。克隆載體pMD18-T Vector，Ampr，購自TaKaRa公司。細菌基因組DNA抽提試劑盒(K1071)、質粒小量提取試劑盒(GK2004)購自上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖膠DNA回收純化試劑盒(D6492)購自Omega公司；DNA Marker、rTaq聚合酶、DNA連接酶購自TaKaRa公司；不溶性Ⅰ型膠原購自生工生物工程(上海)有限公司；其他試劑均為分析純試劑；超濾離心管Amicon Ultra-10購自Millipore公司；純水制備系統購自美國Pall公司；臺式高速冷凍離心機購自Sigma公司；酶標儀購自Thermo公司；PCR儀購自杭州博日科技有限公司；凝膠成像系統購自上海歐翔科學儀器有限公司。

但本領域的普通技術人員在本發明的技術思路下，可以選用已有的其它試劑，而不僅限于本發明的具體記載。

使用的2216E培養基組成如下：0.1％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.01％檸檬酸鐵，過濾海水，用于海洋微生物MB006的培養。LB培養基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化鈉，用于大腸桿菌Rosseta(DH5α)的培養。

實施例1：產膠原蛋白酶菌株的篩選