[發明專利]一種仿刺參種質鑒定方法

有效

• 申請號: 201410826860.0
• 申請日: 2014-12-25
• 公開（公告）號: CN104404166A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 陳百堯;伏光輝;薛學坤;安健;張慶起;張立祥;董志國;孫苗苗
• 申請（專利權）人: 連云港市海洋與水產科學研究所;連云港贛榆佳信水產開發有限公司;連云港帥森海水養殖專業合作社;淮海工學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務所 32255
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種仿刺參種質鑒定方法，其特征在于，所述的鑒定方法步驟如下：

(1)樣本提取：將疑似仿刺參樣本，隨機取樣5g，加液氮在研砵中研成粉末，取0.05g分裝到2mL?EP管中，取樣至少3支；在不能即時提取DNA時，則-20℃保存備用；按常規的酚氯仿法提取DNA，或者用深加工食品DNA提取試劑盒按操作指南提取DNA；

(2)PCR鑒定：

反應條件：

15μl體系：

模板????????0.2μl

2×Taq?PCR?MasterMix????7.5μl

引物?????????1.2μl，上下游引物均為2.5μmol/L

ddH₂O????????6.1μl

PCR反應程序：

引物序列：

(3)鑒定標準：產物8％聚丙烯酰胺凝膠電泳2.5h，銀染顯色后掃描儀成像；引物Aja2-111的結果為111bp的一條帶；引物Aja13-144的結果為144bp的一條帶；引物Aja15-185的結果為185bp和384bp的2條帶；

(4)結果判定：用步驟(2)所述的3對引物擴增出如步驟(3)所述的條帶時，判定樣本是仿刺參。

2.根據權利要求1所述的仿刺參種質鑒定方法，其特征在于，步驟(2)中：所述引物的設計合成方法如下：

(1)將測序得到的引物序列用Seqman程序，進行對比拼接，去除冗余，再將得到的每一個DNA序列輸入到SSR軟件中，找出每DNA序列的重復序列，以及其重復次數；運用Primer?Premier5軟件對所有微衛星序列進行引物設計，設計出上游引物和下游引物共23對，將所得到的引物序列進行合成；所設計的引物序列如下表：

(2)仿刺參合成引物的鑒定

PCR擴增：

建立一個15μl的擴增體系：

上下游引物是根據引物合成單上的ODs值與nmoles?per?OD中的n值向合成引物干粉中添加TE?buffer制成引物原液，再將引物原液與TE以1:39的比例稀釋40倍后用于擴增體系,濃度為2.5μmol/L,；而模板是4地理群體(采自遼寧大連，河北北戴河，山東東營，江蘇連云港的天然水域)24個較好的仿刺參組DNA經過滅菌雙蒸水稀釋5倍后的稀釋液，濃度約為10ng/μl；將這它們用移液槍按要求量移入管中，用過離心將它們混合在一起然后放入PCR擴增儀中進行擴增；

PCR擴增程序

蓋頂溫度:99℃

PCR產物的檢測

擴增出來的PCR產物使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測：將混合液擴增產物進行檢測，配制好的1.0％的瓊脂糖膠液倒入插好梳子的電泳槽中凝固成型，然后拔掉梳子，加入電泳液，沒過膠板0.5-1cm，然后用移液槍將5μl的PCR產物和2μl的溴酚藍指示劑混合均勻后點入瓊脂糖凝膠的點樣孔中；按下開關后，將電壓設置成120V，電流60m然后電泳約30min；電泳結束后營造一個較暗的環境，用手提式紫外線照射儀查看條帶電泳情況，是否跑出條帶，條帶亮度大小；觀察之后再將膠板拿到紫外線凝膠呈像系統觀察，并拍照記錄；將電泳條帶較亮的引物篩選出來，作為下一步實驗用引物；23對引物中，12對引物的條帶亮度較好，較為清晰；最終選定權利要求1所述的3對擴增穩定的引物。