[發明專利]一種可被4’磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列及其用于固定蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201410820070.1
• 申請日: 2014-12-23
• 公開（公告）號: CN104531725A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 王聲斌;汪華珍;孫長勝;袁啟航;陳長超;洪福林;馬皖燕
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/11;C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;C07K17/00;C12N11/00
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列及其用于固定蛋白質的方法。

背景技術

固定化蛋白(酶)呈現貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續及可控、工藝簡便等一系列優點，而且因為具有節省資源與能源、減少或防治污染的生態環境效應而符合可持續發展的戰略要求，在生物醫藥、食品、生物分析及生物學的基礎研究領域具有廣泛的應用。傳統的蛋白(酶)固定方法包括包埋法、交聯法、吸附法及共價結合法來實現酶的固定化。包埋法制備工藝簡便且條件較為溫和、可獲得較高的蛋白(酶)活力回收。交聯法利用游離蛋白(酶)的氨基酸殘基與雙官能團或多功能團交聯劑反應而被固定化，可獲得單位濃度較高的固定化蛋白(酶)。吸附法包括物理吸附和離子結合法，工藝簡便及條件溫和是其顯著特點。目前上述的各種酶固定化方法存在各自的不足，包埋法中高分子凝膠或半透膜的分子尺寸選擇性不利于大分子底物與產物的擴散，交聯法因為較激烈的共價反應而使蛋白(酶)活力損失較大，吸附法中固定的蛋白(酶)易受反應介質pH、離子強度等的影響而從載體上脫落。共價結合法因蛋白(酶)分子與載體之間的共價結合而呈現良好的穩定性及重復使用性，是目前研究最為活躍的一類蛋白(酶)固定化方法，然而非定向的共價固定由于蛋白(酶)在固體介質表面的不均勻分布，常導致蛋白(酶)活性損失較大。目前已開發的蛋白(酶)定向固定化方法，如利用蛋白(酶)與相應抗體的特異性作用、蛋白(酶)與相應配基的特異性相互作用等，操作流程復雜，效率較低，這些不足限制了固定化蛋白(酶)的廣泛應用，成為急待解決的主要問題。目前現有的蛋白質(酶)固定化技術操作流程復雜，缺乏特異性。開發簡便、溫和、適用的固定化方法等是目前固定化蛋白(酶)研究的重要方向，也是目前研究熱點之一。

發明內容

為克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列。

本發明的另一目的提供基于上述的可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列固定蛋白質的方法。

本發明的上述目的通過如下方案予以實現：一種可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列，優選為如核苷酸序列SEQ?ID?NO:1所示的大腸桿菌酰基載體蛋白(ACP)基因序列或如核苷酸序列SEQ?ID?NO:2所示的可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的短肽基因中的一種。

上述的可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列，所編碼的具有生物活性的短肽，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:4所示。

一種重組表達載體，包含上述的可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列，用于將目的蛋白與其融合表達。

上述的重組表達載體的具體制備步驟為：將可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列與目的基因重組融合構建到表達載體獲得；所述的表達載體優選為表達載體pET系列載體。

一種包含上述重組表達載體的大腸桿菌的重組表達系統；具體為：將上述重組表達載體轉化進大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，培養至OD600為0.5～0.7，加入終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于30℃誘導蛋白表達10h；5000g，10min，4℃離心收集菌體，獲得表達融合目標蛋白的大腸桿菌。

一種基于上述的可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列固定蛋白質的方法，由上述的大腸桿菌的重組表達系統，獲得包含目標蛋白的融合蛋白，經酶AcpS或Sfp催化進行4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾，然后進行固定化，實現固定目標蛋白。

所述的固定化為在固定化緩沖液中按1mg：0.2ml的比例將重組蛋白與SulfoLink?coupling?resin(Thermo?Scientific)混合，30℃溫浴1h，實現蛋白固化。

所述的固定化緩沖液為50mmol?Tris?HCl，5mmol?EDTA-Na，pH?8.5。

本發明提供的蛋白(酶)固定化技術應用可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的蛋白質(短肽)作為融合標簽，與目標蛋白融合表達，利用4’-磷酸泛酰巰基乙胺的巰基(-SH)與固體介質上的活性基團特異性反應，形成牢固的共價鍵，將目標蛋白穩定地固定到固體介質上，且目標蛋白在固體介質表面分布均勻，活性高；同時進行固定化反應時條件溫和，不會導致蛋白質變性，整個固定化反應可在1小時內完成，效率極高。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：