[發明專利]一種分離純化胰蛋白酶的方法及含有胰蛋白酶的藥物組合物

在審

• 申請號: 201410819332.2
• 申請日: 2014-12-25
• 公開（公告）號: CN104593345A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 劉乃山;林曉磊;劉翠珍
• 申請（專利權）人: 青島康原藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;A61K38/48;A61P29/00
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及純化胰蛋白酶的方法。

背景技術

胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近（23300），其等電點約為pH10.8，最適pH7.6～8.0，在pH=3時最穩定，低于此pH時，胰蛋白酶易變性，在pH>5時易自溶；Ca²⁺離子對胰蛋白酶有穩定作用。

胰蛋白酶能催化蛋白質的水解，對于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現為對堿性氨基酸一端的選擇。

胰蛋白酶作為蛋白酶的一種，不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。

此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創傷性損傷、瘺管等所產生的局部水腫、血腫及膿腫等。還可用于治療毒蛇咬傷，也常用于動物細胞培養前對組織的處理。

用傳統的方法僅提取胰蛋白酶是相當困難的。2006年7月上海阿敏制藥有限公司公開了一種糜胰蛋白酶的制備方法（200610023582.0），其采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析的產品工藝，得到糜胰蛋白酶。2011年1月馬忠仁等申請了一種提取糜胰蛋白酶的方法（200910170682.X），其采用了CaCl₂激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時加入飽和度的（NH₄）₂SO₄，使其生成硫酸鈣沉淀吸附糜胰蛋白酶，經過洗脫、鹽析、超濾和凍干獲得白色的糜胰蛋白酶的凍干粉末。產品均為糜胰蛋白酶，沒有單純的胰蛋白酶提取分離純化。

發明內容

本發明的目的是將提取的胰蛋白酶純化，得到較高純度的胰蛋白酶。相對于現有技術，本發明成本低，產品胰蛋白酶效價高，適合于規模化生產。

本發明的技術方案是：將胰蛋白酶粗品溶解后，經鹽溶、鹽析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再經結晶透析、凍干的方法，即可得較高純度的胰蛋白酶，包括如下步驟：

（1）投料：稱取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2～4ml的水攪拌溶解，調節pH至3.0±0.5，以助其溶解，攪拌10～16小時；計量溶液體積，按400～500g/L比例加入固體硫酸銨，待其溶解后，靜置沉淀10～16小時；

（2）鹽溶：將溶液過濾，稱量濾餅重量，先按每克濾餅加入2~4ml的水，攪拌溶解后，調節pH至3.0±0.4，再按每克濾餅加入1～3ml的飽和硫酸銨溶液靜止沉淀10～16小時；

（3）鹽析：將溶液過濾，量取濾液體積，加入等體積量的飽和硫酸銨溶液，靜置沉淀10～16小時；

（4）洗鎂：將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重，待活化；

（5）活化：稱濾餅重量為A千克，將濾餅溶于3A～5A升的0.001～0.01mol/L鹽酸溶液，另加入0.5～2mol/L氯化鈣溶液A～3A升及pH7.5～8.5硼酸緩沖液4A～6A升，再加入6A～9A升的水，調節pH至7.0～8.0，最后每克濾餅加5～15mg的結晶胰蛋白酶進行活化，將溶液置0～10℃中靜置60～80小時進行活化，?pH控制在7.0～8.0；

（6）除鈣：活化后的溶液，調節pH至3.0±0.4，再按200～300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在0～10℃中存放32～60小時使硫酸鈣沉淀，過濾，濾液按150～250g/L加入固體硫酸銨，在0～10℃中靜置10～14小時，過濾，得濾餅；

（7）結晶：按每克濾餅加入1～2mlpH8.0～10.0硼酸緩沖液，調節pH至8.0±0.4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，0～10℃時浸于外透液中，結晶3～7天；

（8）透析：取出結晶液過濾得結晶物，再按每克結晶物加入1～3ml水溶解，調節pH至3.0±0.5；將溶液透析2～4天，去除雜質，每10～14小時左右透析池換水一次，溫度控制在0～10℃；

（9）凍干：取出透析液，加入少量硅藻土，抽濾，得濾液，調節pH至6.0±0.4，進凍干機凍干后得結晶胰蛋白酶成品。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明：

實施例1