[發明專利]糞便取樣提取黔金絲猴基因組DNA的方法

在審

• 申請號: 201410816416.0
• 申請日: 2014-12-25
• 公開（公告）號: CN104480104A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 張志敏;肖代敏;李學英;潘有福;錢剛
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 遵義市遵科專利事務所 52102
• 代理人: 陳源鴻

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種糞便取樣提取黔金絲猴基因組DNA的方法。

背景技術

黔金絲猴（Rhinopithecus?brelichi）隸屬于靈長目（Primates）猴科（Cercopithecidae）仰鼻猴屬（Rhinopithecus），是傳說中美猴王孫悟空的原形，外形惹人喜愛，具有相當觀賞價值。在我國特有的三種金絲猴中，黔金絲猴數量最少，棲息地最狹窄，是珍稀保護動物，被譽為“世界的獨生子”，僅存800只左右分布于貴州省梵凈山自然保護區約340平方公里范圍內，比國寶大熊貓還要稀少。早在1989年就列為我國一級重點保護動物；1996年列入瀕危動物紅皮書瀕危（E級）^[1]。保護黔金絲猴既是保護自然環境的重要內容之一，也與人類自身生存息息相關，對黔金絲猴遺傳變異水平和群體遺傳結構的深刻認識，能制定合理、科學、有效的保護措施，這對于極度瀕危的黔金絲猴來說是迫在眉睫。但是，由于野外黔金絲猴采集血樣困難，保護遺傳學研究難以全面深入展開。

非損傷性取樣（non-invasive?sampling）是在不捕捉和不干擾動物正常活動情況下，收集動物脫落毛發、糞便、口腔黏膜細胞、尿液等樣品，從中獲取DNA的方法。其中糞便含有成千上萬的腸壁脫落細胞，是最具潛力的DNA資源^[2,3]。1992年Matthial?H?ss等^[4]首先用糞便做材料對棕熊線粒體控制區141?bp的片段進行分析，標志著糞便DNA分析技術建立；1997年，Jane?Z?Reed等^[5]首次提出分子糞便學（molecular?scatology）概念，提倡運用分子糞便學技術，以PCR為基礎，有效開展個體識別、性別鑒定、野外種群遺傳結構分析和種群大小預測等研究。糞便提取DNA的可靠性已經在許多文獻中證實，丁波等^[6]通過實驗證實對糞便DNA進行特異性擴增是可靠的；M?A?J?Frantzen等^[7]在對不同方法保存糞便的效果進行討論時指出，超過60%的糞便DNA樣品可以獲得與血液DNA一致的結果；?Ernest?H?B等^[8]運用12個微衛星標記對美洲獅糞便DNA進行分析的結果也表明，糞便DNA可以獲得與肌肉樣品一致的基因型結果。張志敏^[9]通過糞便取樣對亞洲黑熊腦源性神經營養因子全長基因分析證實糞便取樣的可靠性。

目前關于黔金絲猴的報道僅幾篇，主要集中在個體水平上黔金絲猴形態習性、生態環境和人工飼養等方面描述[13,14]；國內楊眸宇等（2002年）用放射免疫法對黔金絲猴血清TEST與E2進行測定[15]；李明等（2004年）報道了從線粒體DNA細胞色素b（402bp）和12SrRNA（387bp）基因片段推斷四種金絲猴間種系發生關系，認為金絲猴是一個獨立屬，川金絲猴、滇金絲猴和越南金絲猴可能是從黔金絲猴中分化出來的種[16]；Yang?M?et?al（2009年）評價了黔金絲猴的生殖參數，認為黔金絲猴比川金絲猴和滇金絲猴面臨更高滅絕風險[17]；但是，由于采集血樣的限制，相關研究進展比較緩慢。

Pierre?Taberlet等[18]曾指出，用糞便樣品作為實驗材料，通過多次重復實驗，結果的可靠性可達到99%，同時為排除污染，提取過程中設置陰性對照十分必要。本文參照問現在中方法，但對方法中酚氯仿抽屜去除蛋白質的方法改進為94℃加熱10min讓蛋白質變性[10,11]，操作簡便、試劑成本低、所提取的DNA純度高。因此，該方法在分子糞便學中值得推廣。在糞便DNA提取和PCR擴增過程中均設置陰性對照，甚至對抽提陰性對照進行PCR擴增，排除實驗過程中人為操作造成污染的可能性；同時以毛發做陽性對照和多次重復實驗，監測糞便中各種雜質和微生物可能造成的污染，徹底排除污染干擾。為獲得準確可靠的實驗結果，作者對采集的糞便樣品做3次重復抽提DNA；每次糞便抽提做十管（包括陰性對照），平均而言有6～8管可以得到有效擴增產物（60～80%），這個比例已經相當高；對每次提取的糞便基因組DNA做三次重復PCR擴增，選取其中六個擴增良好的PCR產物和兩次毛發DNA擴增產物電泳，其中3個糞便和一個毛發擴增產物用于測序，獲得相同結果，充分證明本實驗的準確性和可靠性。