[發明專利]一種檢測結核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201410815076.X
• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN104531865A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 徐洪濤;王璨;項光新;邢婉麗;程京;梁建琴;趙雁林
• 申請（專利權）人: 博奧生物集團有限公司;清華大學;中國人民解放軍第三○九醫院;中國疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

技術領域

本發明涉及一種檢測結核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

結核病是單一致病菌感染導致死亡率最高的感染性疾病。目前，全球約有1/3的人感染了結核桿菌，每年死于結核病的人數達到300萬。我國是全球22個結核病流行嚴重的國家之一，位居全球第2位。第五次全國結核病流行病學抽樣調查顯示，全國15歲及以上人群肺結核的患病率為459/10萬，肺結核患者耐多藥率為6.8％。結核病與艾滋病等疾病伴發以及多藥耐藥等現象致使我國結核病的防控形勢嚴峻。

結核分枝桿菌耐藥性的機制大致有三種類型：即降低細胞膜的通透性和外排泵機制，產生降解或滅活酶類，藥物靶位的改變。結核桿菌無法通過質粒的介導從其他細菌獲得耐藥性，因此染色體介導的耐藥性是MTB(結核分枝桿菌)產生耐藥的主要基礎。目前對MTB耐藥分子機制的研究主要集中在藥物的作用靶位及其相關基因的突變上。

利福平作用于結核桿菌DNA依賴的RNA聚合酶亞基β亞單位(RNA?polymerase?B?subunit，rpoB)，從而抑制mRNA的轉錄。結核分枝桿菌對利福平耐藥是結核病化療失敗的主要原因，當rpoB高度保守核心區域(RRDR)發生突變時利福平不能與RNA聚合酶β亞單位結合，抑制轉錄。主要的突變集中在編碼27個氨基酸的81個堿基范圍內(Hillemann?D?et?a1.Use?0f?the?Genotype?MTBDR?assay?for?rapid?detection?of?rifampin?and?isoniazid?resistance?in?Mycobacterium?tuberculosis?complex?isolates[J].J.Clin.Mierobiol，2005，43：3699-3703.)。其中，以531TCG→TTG、526CAC→GAC、CAC→TAC、CAC→CGC和CAC→CTC的突變最為常見(崔振玲等.基因芯片檢測結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性研究[J].中華結核與呼吸雜志，2004，7(27)：439-441.)，除上述兩位點外，511、516、533、522位點也有突變。

結核分枝桿菌對抗結核化療藥物異煙肼(INH)的耐藥機制較為復雜，約92％的INH耐藥菌與katG，inhA和ahpC三個基因突變有關。其中katG和inhA基因是主要的耐藥基因。katG的丟失或突變導致其編碼的過氧化氫-過氧化物酶活性喪失或下降，而inhA基因突變減弱了異煙肼對分枝桿菌酸生物合成的抑制作用。katG基因常見突變發生在315位點上即315AGC→AAC或者AGC→ACC，inhA基因的突變位點為-15C→T。

最近的研究表明結核分枝桿菌耐乙胺丁醇與阿拉伯糖基轉移酶的編碼基因。embABC操縱子突變或emb蛋白表達增高有關，該操縱子由embC、embA和embB三個基因組成，其中embB基因(尤其是306位密碼子)突變是耐乙胺丁醇產生的主要分子機制。約47％-65％的耐EMB菌株與embB基因突變有關(Ramaswamy?S?et?a1.Molecular?genetic?analysis?of?nucleotide?polymorphisms?associated?with?ethambutol?resistance?in?human?isolates?of?Mycobacterium?Tuberculosis[J].Antimicrob?Anents?Chemother.2000，44(2)：32.)，常見突變位點為306ATG→ATA或ATG→GTG。

鏈霉素是抗結核治療中常用的氨基糖苷類抗生素，鏈霉素主要作用于結核分枝桿菌的核糖體，誘導遺傳密碼的錯誤，抑制mRNA轉譯的開始，干擾轉譯過程中的校對，從而抑制蛋白質合成(Honore?N，Cole?S?T.Streptomycin?resistance?in?mycobactefia[J].Anlimiorob?Agents?Chemother，1994，38(2):238.)。最近研究認為鏈霉素耐藥是由于其核糖體S12蛋白編碼基因rpsL或16SrRNA編碼基因rr8突變所致，80％耐鏈霉素結核分枝桿菌臨床分離株可見rpsL突變(李國利.結核分枝桿菌耐藥分子機制及耐藥基因檢測方法研究進展[J].中國醫師雜志，2002，4(4)：338-340.)。rpsL基因最常見的是43位密碼子AAG→AGG的突變和88位密碼子AAG→AGG的突變。