[發(fā)明專利]基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的A組輪狀病毒的層析試紙條

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410814970.5
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104502608A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張捷;張巖;楊向瑩;李錦豐;張惠媛;劉潔;張曉光;舒咬根;陳廣全
• 申請（專利權(quán)）人: 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心;河北省食品檢驗研究院;中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11250
• 代理人: 趙敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品(醫(yī)學)檢測領(lǐng)域，具體地說涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體之一，其主要感染小腸上皮細胞，從而造成細胞損傷，引起腹瀉。輪狀病毒每年在夏秋冬季流行，感染途徑為糞－口途徑，臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎，呈滲透性腹瀉病。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的輪狀病毒對人類的安全具有危險，該菌在低溫仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，必須加以重視。目前，輪狀病毒已經(jīng)作為致病菌檢測的一項重要指標，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗檢疫中均有重要的意義，同時也對輪狀病毒的快速及高精度的定量檢測提出了更高的要求。為探求快速、準確、高靈敏度、易操作且能夠定量的檢測方法，世界各國學者進行了大量研究，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學、分子生物學為基礎(chǔ)的快速檢測方法，并在實踐中不斷取得新進展。

免疫層析技術(shù)是一項有效結(jié)合了層析法卓越分離能力和免疫反應(yīng)高度特異性的新型免疫檢測技術(shù)，當前在疾病快速診斷、環(huán)境污染物分析及致病生物因子檢定等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。其原理是將特異抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當遷移至交聯(lián)標記抗體的特定區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原-標記抗體復合物，經(jīng)標記物的顯色、發(fā)光或電化學反應(yīng)而使該區(qū)域顯示一定的信號，從而實現(xiàn)特異性免疫診斷。常用的標記物包括生色型探針(包括膠體金、膠體碳、著色微球等)和熒光分子(如有機熒光染料、量子點、稀土元素配合物、上轉(zhuǎn)磷光顆粒等)。

然而上述的標記物卻存在靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量檢測等缺陷，進而限制了免疫層析技術(shù)的廣泛應(yīng)用。如現(xiàn)有技術(shù)中常見的利用酶標記催化生色底物的酶促反應(yīng)而顯色，可用于抗原或抗體的直接檢測，將該方法應(yīng)用于食品中輪狀病毒的檢測，通過單克隆抗體大大降低假陽性率，但是該方法的靈敏度較分子生物學方法低，且必須經(jīng)過增菌篩選純培養(yǎng)步驟，因此難以在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果。

對于現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術(shù)，通過膠體金等納米顆粒的聚集反應(yīng)而顯色，從而實現(xiàn)結(jié)果判定。雖然該種方法具有便捷、快速、準確和無污染等特點被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學檢測和臨床診斷，在病原體檢測方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學方法無可比擬的優(yōu)勢，且無需特殊儀器設(shè)備，對檢測人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應(yīng)用開發(fā)前景。但這種方法中存在標記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一，靈敏度較低，受基質(zhì)的背景干擾大等缺陷，且只能定性檢測，不能做到精確定量檢測，上述標記靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量，限制了免疫層析技術(shù)的應(yīng)用。

另外，現(xiàn)有免疫層析技術(shù)一直主要用于對蛋白類的檢測，對于微生物的檢測則所見甚少，同時更難以實現(xiàn)微生物的定量檢測，對于快速檢測致病菌而言，其應(yīng)用受到極大的限制。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有技術(shù)中難于快速定量檢測輪狀病毒的問題，進而提供一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，并進一步公開了其應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，包括：

底板以及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜和吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜和吸水墊之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線靠近所述結(jié)合墊，所述質(zhì)控線靠近所述吸水墊；

所述結(jié)合墊上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與A組輪狀病毒特異性結(jié)合的單克隆抗體；

所述檢測線由可與所述輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì)控線由與所述輪狀病毒以及所述可與輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體涂層形成。

所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，所述結(jié)合墊上噴涂的所述可與A組輪狀病毒特異性結(jié)合的單克隆抗體為鼠抗A組輪狀病毒衣殼蛋白單克隆抗體。

所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，形成所述檢測線的可與A組輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體為羊抗A組輪狀病毒多克隆抗體。

所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，形成所述質(zhì)控線的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體。