[發(fā)明專利]一種新的治療肺癌的Derp1納米疫苗及其制備方法和用途

有效

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• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN104524565B
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發(fā)明（設計）人: 左建宏;劉志剛;肖小軍
• 申請（專利權）人: 南華大學
• 主分類號: A61K39/35
• 分類號: A61K39/35;A61K39/39;A61P35/00
• 代理公司: 衡陽市科航專利事務所43101
• 代理人: 劉勛階

技術領域

本發(fā)明涉及新型疫苗發(fā)明領域，具體地說是一種新的治療肺癌的Der p1納米疫苗及其制備方法和用途。

背景技術

肺癌已經成為全球范圍內所有癌癥發(fā)病率的首位，其五年存活率大約為15％，約30-40%的肺癌患者發(fā)生骨轉移，一旦發(fā)生骨轉移，其中位生存時間只有7個月。美國2012年肺癌有超過163萬新發(fā)病例及57萬死亡病例。肺癌同時也超過肝癌成為了我國第一大高發(fā)癌癥，且發(fā)病率及死亡率增長最為迅速，每年以13%的速度增長。目前，肺癌占據(jù)癌癥發(fā)病率排行（男女綜合）的首位，其中在男性發(fā)病率中排第一，在女性癌癥發(fā)病率中也始終排在前三位。預計到2025年，中國每年新增肺癌病例將超過100萬例。肺癌患者還呈現(xiàn)年輕化趨勢，尤其是近幾年來，45歲以下的肺癌患者多有出現(xiàn)。因此，肺癌已經嚴重影響威脅我國人民的生命健康。

目前治療方法主要有手術治療、化療、放療等方法。縱觀目前的療法，手術治療主要適合早中期（I~II期）肺癌和腫瘤局限在一側胸腔的部分選擇性的IIIb期肺癌，和放療同屬局部治療，從腫瘤生物學角度看，癌癥是全身性疾病，存在轉移和擴散的特性；常規(guī)的放療和化療等治療方式，在殺死腫瘤細胞的同時也損傷機體正常細胞和免疫系統(tǒng)，降低免疫力，毒副作用大。因此，開展新的抗癌藥物的研發(fā)重要且必要，尋找對抗癌效果好且對正常組織毒害小、不損害機體免疫的藥物的確迫切需求。經過我們發(fā)明人前期研究表明，屋塵螨Der p1疫苗對肺癌的治療有著顯著的作用，且能增強機體免疫能力，具有抗癌功能。

本發(fā)明采用基因工程技術在大腸桿菌中克隆和表達制備重組Der p1蛋白，克服了從螨體中大量提取的困難。同時采用PLGA納米佐劑制備塵螨重組變應原Der p1疫苗，用于治療肺癌。本發(fā)明國內外尚未見報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的之一是克服現(xiàn)有技術的上述不足，而提供一種新的治療肺癌的Der p1納米疫苗。

實現(xiàn)本發(fā)明上述發(fā)明目的的技術方案是：一種新的治療肺癌的Der p1納米疫苗，其是采用如下步驟制備而成的：

步驟一，用基因工程技術制備重組屋塵螨變應原Der p1：

（1）挑取單個含重組表達質粒重組pET-24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接種于含50μg/ml卡那霉素的LB中，35~37℃，160~240rpm搖菌過夜，按1~4%的接種量將基因工程菌菌落接種于LB/kam培養(yǎng)液中，200~300rpm搖菌至OD600為0.5~0.7時，加入IPTG使其終濃度為0.1~0.4mM，誘導4~6小時后，2000~4000g在2~6℃離心5~15min，去上清，沉淀用1xPBS洗滌，將細菌重懸于40ml 1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至終濃度0.4~0.6mg/ml，DTT至終濃度5~15mM，PMSF至終濃度0.8~1.2mmol/L，Triton X-100至終濃度0.8~1.2%，并于室溫中振蕩20~40分鐘，制成基因工程菌培養(yǎng)物裂解液，-80℃保存；

（2）將裂解液置于冰浴下40W超聲5~15遍，超聲20~40s、停20~40s，直至菌體不粘為止，10000~12000g3~5℃離心10~20min，去上清，得基因工程菌包涵體；

（3）在冰浴下，用100ml包涵體洗液1重懸沉淀，并磁力攪拌20~40min，10000~12000g3~5℃離心10~20min，去上清，再依次用包涵體洗液2和包涵體洗液3重懸，冰浴磁力攪拌，離心去上清，最后將沉淀溶于20ml包涵體溶解液中，10000~12000g離心30min，棄沉淀，得包涵體；

由于重組蛋白N-端帶有6-His標簽，故通過Ni²⁺金屬螯合層析進行重組Der p1親和層析純化，得重組屋塵螨變應原Der p1；

步驟二，制備PLGA-塵螨應變原Der p1﹙PLGA-Der p1﹚納米疫苗：

稱50mg PLGA溶于二氯甲烷中，再加入100μL已制備好的濃度為100mg/ml的重組屋塵螨應變原Der p1，混旋1min，40w，超聲乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 濃度為2%的聚乙烯醇(PVA)，再超聲乳化1~2 min，形成復乳液，然后將復乳液轉移至50ml的雙蒸水中，室溫下攪拌3~5h，使有機溶劑充分揮發(fā)，10000rpm/ min離心10min，離心收集微粒，再用雙蒸水洗滌，最后真空冷凍干燥成微粒粉末狀的PLGA-塵螨變應原Der p1納米疫苗，4℃保存。