[發明專利]一種獲得辣椒疫病抗性候選基因及分子標記的方法及應用

在審

• 申請號: 201410811975.2
• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN104560973A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 刁衛平;王述彬;劉金兵;潘寶貴;戈偉;郭廣君;高長洲
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

1.一種獲得辣椒疫病抗性候選基因及分子標記的方法，該方法包括：

1）辣椒轉錄組測序：利用辣椒高抗和高感疫病材料雜交獲得F₁，F₁自交獲得F₂，對F₂群體進行辣椒疫霉菌接種，分別采集F₂群體接種0天和5天后的樣品備用；接種辣椒疫霉菌10天后，調查F₂群體發病情況，分別選取15株辣椒高抗和高感疫病單株構建辣椒疫病抗、感基因池，命名為KC0（抗池對照）、KC5（接種5天后的抗池）、GC0（感池對照）和GC5（接種5天后的感池），利用測序儀器對抗、感池分別進行轉錄組測序；

2）差異基因表達分析：利用生物信息學軟件對4個辣椒疫病抗、感基因池的測序數據進行合并組裝，首先將各樣品數據進行低質量過濾，使Q20達到99%以上，再將過濾后各樣品數據合并在一起根據相似度進行聚類，在聚類單元中選取最長的序列作為Unigene序列，完成Unigene庫的構建，利用RPKM值反映對應Unigenes的表達豐度，再利用生物信息學軟件EBSeq篩選出在辣椒疫病抗、感基因池之間差異表達的基因；

3）差異基因功能注釋：在NCBI網站上使用Blastn、Blastp和InterProscan軟件對篩選到的差異表達基因進行數據庫比對，獲得差異表達基因的注釋信息和蛋白質功能預測結果，根據注釋信息和蛋白質功能預測結果進一步篩選出與辣椒疫霉病抗性相關的差異表達基因；然后利用上述差異表達基因片段，在辣椒全基因組數據庫（http://peppergenome.snu.ac.kr和http://?peppersequence.genomics.cn）中進行Blastn比對，獲得差異表達基因即辣椒疫病抗性相關基因完整的開放閱讀框（ORF）；

4）SNP位點的鑒定：針對所獲得的辣椒疫病抗性相關基因ORF的序列特征，利用生物信息學軟件設計特異引物；對辣椒高抗疫病和高感疫病材料進行擴增，擴增產物經瓊脂糖電泳后，回收、克隆并測序；利用生物信息學軟件DNAman對高抗和高感疫病辣椒材料的擴增產物進行序列比對，找出辣椒疫病抗性相關基因序列在高抗和高感疫病辣椒材料中存在的SNP位點；

5）辣椒疫病抗性候選基因的獲得：針對辣椒疫病抗性相關基因序列在辣椒高抗和高感疫病材料中所鑒定到的SNP位點特征，利用生物信息學軟件設計特異SNP引物對高抗和高感辣椒疫病材料以及高抗和高感疫病材料雜交、自交獲得的F₂群體進行擴增，同時對高抗、高感以及F₂群體進行辣椒疫霉菌接種，10天后調查發病情況；最后，SNP標記擴增結果結合上述材料的疫霉菌接種鑒定結果，篩選到只在高抗材料中擴增出條帶，而在感病材料中無擴增條帶的引物，此類引物對應的基因即為辣椒疫病抗性候選基因。

2.權利要求1所述的一種獲得辣椒疫病抗性候選基因及分子標記的方法的應用，其特征在于包括：

1）辣椒疫病抗性候選基因及分子標記的方法為先進行辣椒疫病轉錄組測序找到差異表達

基因，再進行差異表達基因的功能注釋以及蛋白質功能預測，找到與其他作物疫病抗性基因

同源性較高的辣椒疫病抗性相關基因，再根據抗性相關基因設計引物，在不同辣椒抗、感疫

病材料中擴增，比對序列差異，發現存在與抗、感辣椒疫病材料中的SNP位點，再根據SNP

位點特征設計特異進行引物的有效性驗證，最后獲得辣椒疫病抗性候選基因及分子標記；

2）用于辣椒轉錄組測序樣品為高抗和高感辣椒疫病材料雜交、自交獲得的F₂群體經接

種辣椒疫霉菌0-5天抗之內的抗、感基因池；

3）獲得的5個辣椒疫病抗性候選基因分別為CARpi-1，CARpi-2，CARpi-3，CARpi-1，CARpi-4和CARpi-5，5個基因對應的在2個辣椒全基因組數據庫中對應的ID號分別為CA00g85670、CA11g14390、CA03g00800、CA10g12800和CA11g04330（http://peppergenom?e.snu.ac.kr）和Capana02g001506、Capana11g000418、Capana03g004163、Capana10g001567和Capana11g001783（http://peppersequence.genomics.cn）；

4）利用辣椒疫病抗性候選基因開發的SNP分子標記用于辣椒疫病抗性育種材料的選育。