[發明專利]用于抗體親和力成熟篩選的細胞株及其使用方法

有效

• 申請號: 201410803422.2
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN104531623B
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 杭海英;陳川;趙云
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所11430
• 代理人: 郎堅

技術領域

本發明屬于生物醫藥及抗體工程領域，具體而言，涉及一種用于抗體親和力成熟篩選的細胞株及其使用方法

背景技術

抗體的親和力進化系統是抗體工程和大分子生物制藥行業都十分關心的重要技術，在抗體的親和力進化篩選過程中，對目標抗體的展示，是基礎的步驟，常用的體外展示系統包括如噬菌體展示系統、酵母展示系統或細菌展示系統，近年來，基于哺乳動物細胞的展示系統同樣得到了很大的發展，相比其他展示系統，哺乳動物展示系統在蛋白的折疊，翻譯后修飾以及密碼子偏好等方面有很多的優勢，體細胞突變(SHM，somatic hypermutation)結合胞嘧啶脫氨酶誘導激活(AID，activation-induced cytidine deaminase)技術，能夠通過誘導胞嘧啶變為尿嘧啶，使蛋白的氨基酸序列變化，從而改善抗體親和力，目前，已有報道利用AID誘導的體細胞高頻突變原理在不同的細胞系中(293T、H1299等)建立了各種抗體親和力成熟體系，然而這些系統耗時都比較長，而且抗體親和力成熟效率不夠高。主要體現在如下幾點，

(1)這兩個細胞生長速度偏慢(倍增時間約為22個小時)，而且對外源的轉染載體耐受性不是很強(例如，用lipo2000轉染293T后有相當一部分細胞死亡)，同時，經流式分選后存活率也較低；

(2)以兩個細胞為基礎的親和力成熟體系的抗體親和成熟過程，往往需要進行8輪以上的親和力成熟過程才能得到高親和力的抗體，由于生長緩慢且存活率較低，每輪進化所需要的時間更長，也導致了實驗效率低下的結果。

綜上，哺乳動物抗體進化系統還有大的提升空間，需要一種穩定高效的抗體親和力成熟系統。

CHO細胞是抗體表達中常用的哺乳動物細胞，在治療性抗體的表達中應用最為廣泛，該細胞生長速度快(倍增時間大約16個小時)，耐受性強，并且生產的抗體具有同人源抗體相同或者類似的修飾，所以，選擇CHO細胞為基礎，結合重組酶介導的盒式替換技術(recombinase-mediated cassette exchange，RMCE)，有望建立更高效率且更簡便的抗體親和力成熟系統。

發明內容

本發明涉及一種利用重組酶介導的盒式替換(RMCE)技術建立的只含有單拷貝重組替換位點的用于目標抗體親和力成熟篩選的CHO細胞系PuroR-14，所述PuroR-14細胞保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，編號CGMCC No.9717，保藏日期2014年10月9日，分類命名：CHO-FRT-Puro-loxP，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

所述的PuroR-14細胞重組替換位點含有一個puromycin抗性基因，該基因前端含有一個CMV啟動子，兩邊分別加上了FRT和loxP序列形成一個FRT-puromycin-loxP結構。在重組酶Flp和Cre共同作用下該位點能夠與同樣含有FTR和loxP位點的抗體展示基因(FRT-Ab-TM-loxP)相互替換，替換進入的抗體基因在FRT前端的CMV啟動子做用下轉錄、翻譯，從而將抗體展示到細胞表面。

優選的，所述的替換抗體為單鏈抗體，替換的抗體基因不包含啟動子。只有替換成功的抗體基因才能在CMV啟動子的作用下轉錄表達，故每一個細胞中只有一個抗體基因表達，排除了多基因同時表達的影響。

本發明還涉及一種使用所述PuroR-14細胞系對目標抗體進行親和力成熟篩選的方法，所述方法包括如下步驟，

(1)構建含有FTR和loxP位點的目標抗體展示基因，

(2)將所述的目標抗體展示基因替換所述PuroR-14細胞的重組替換位點FRT-puromycin-loxP，

(3)通過體細胞高頻突變(SHM，somatic hypermutation)和流式分選，經1～8輪分選，對所述抗體進行親和力成熟篩選。

優選的，所述的目標抗體為單鏈抗體，目標抗體展示基因不包含啟動子。

優選的，步驟(3)所述的分選輪數為5輪。

優選的，通過在所述替換了目標抗體展示基因的PuroR-14細胞中轉染胞嘧啶脫氨酶誘導激活(AID，activation-induced cytidine deaminase)所述體細胞高頻突變(SHM，somatic hypermutation)。

附圖說明