[發明專利]一種獲取牛干擾素α的基因的引物、重組牛干擾素α的制備方法

在審

• 申請號: 201410799328.4
• 申請日: 2014-12-20
• 公開（公告）號: CN104531691A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 王明麗;趙俊;李樹啟
• 申請（專利權）人: 安徽九川生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C07K14/56;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司 34107
• 代理人: 朱圣榮

技術領域

本發明屬于基因重組技術領域,具體涉及一種獲取牛干擾素α的基因的引物、重組牛干擾素α的制備方法。

背景技術

隨著近年來全球畜禽養殖業的迅猛發展，我國養牛業已由農村家庭副業發展成了社會一大產業，無論是獸類的品種還是數量都位于世界前列。然而，養獸業還存在很多問題，如水皰性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞病毒等傳染性疾病，每年都會在不同的季節暴發，這些動物一旦感染發病，則初發病急、臨床癥狀嚴重、極易傳播擴散以及病死率和死亡率均較高的特點，給養殖業造成巨大經濟損失。

目前獸類傳染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和藥物治療，由于疫苗免疫的血清型單一，而病毒的血清型復雜，毒株變異快，常導致疫苗免疫失敗。一些病毒病目前尚無疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人類的健康。

常用的藥物治療主要采用抗生素進行治療，但是近年來由于抗生素的廣泛和大量使用，導致耐藥性菌株大量產生，并通過食物鏈傳染給人，給人類健康帶來更大的威脅。現在一些國家己明令禁止一些抗生素和抗菌劑在養殖業中的應用。因此，使用干擾素來積極治療和預防家禽、家畜的病毒性疾病將是人類最為關注的問題。

干擾素(Interferon，IFN)是一類由病毒及脂多糖等物質誘導機體產生的具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用的蛋白質，1957年由Issacs和Lindeman首先發現。它是一類多功能的細胞因子，與細胞受體結合后，可誘導機體產生多種特異性蛋白質和酶類，主要通過抑制病毒基因轉錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖及發揮抗腫瘤等的活性。按照IFN的產生細胞、生化特征及在機體免疫方面所發揮的作用不同，分為α、β、γ三種型。現已知，干擾素α在體內可有選擇性地作用于病毒感染細胞，通過抑制受染細胞內的病毒蛋白質的生物合成，發揮廣譜和高效抗病毒作用，但對正常宿主細胞無作用。

目前重組牛干擾素α鮮有報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種獲取牛干擾素α的基因的引物和一種重組牛干擾素α的制備方法，制備的重組牛干擾素α可用于治療牛水皰性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞病毒等引起的疾病。

一種獲取牛干擾素α的基因的引物，所述引物的序列為：

上游：ATA?GGA?TCC?TGC?CAC?CTGGCCT?CAC

下游：ATA?AAG?CTT?TCA?GTC?CTT?TCT?CCT?G；

引物分別帶有BamHI和HindIII酶切位點。

本發明提供的一種重組牛干擾素α的制備方法，包括以下步驟：

a、牛干擾素α基因的獲取；

b、構建克隆載體；

c、構建表達載體；

d、重組蛋白的表達；

e、重組牛干擾素α粗制品的制備；

f、重組牛干擾素α粗制品純化。

步驟a、牛干擾素α基因的獲取，包括以下步驟：

采用TAKARA公司RNA提取試劑盒從牛肝臟組織中提取RNA，并利用引物進行RT-PCR反應；

引物序列：上游：ATA?GGA?TCC?TGC?CAC?CTGGCCT?CAC

下游：ATA?AAG?CTT?TCA?GTC?CTT?TCT?CCT?G

引物分別帶有BamHI和HindIII酶切位點；

牛干擾素α目的基因如SEQ?ID?NO?1所示；

提取RNA反應條件：在25μL的總反應體系中，基因組DNA?1.5μl，上下游引物各0.5μl，PCR?Mix為12.5μl，加無菌水至25μl；

RT-PCR反應條件：94℃預變性3min；94℃變性30S，55℃退火40S，72℃延伸40s，循環35次，最后72℃延伸20min，RT-PCR擴增產物通過膠回收試劑盒回收。

步驟b、構建克隆載體，包括以下步驟：

PCR擴增牛干擾素α目的基因后，將目的基因克隆于pMD18-T?simple?vector至并轉化JM109大腸桿菌涂LB培養基平板進行藍白斑篩選，取白色樣的克隆菌進行目的基因PCR驗證，并進行雙酶切鑒定。

步驟c.構建表達載體，包括以下步驟：