[發(fā)明專利]降解或檢測甘油磷酸膽堿的酶學(xué)方法、產(chǎn)品及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410798258.0
• 申請日: 2014-12-18
• 公開（公告）號: CN105784980B
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐正軍;周美鳳;許駿;楊天奎
• 申請（專利權(quán)）人: 豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

本發(fā)明提供了降解或檢測甘油磷酸膽堿(GPC)的酶學(xué)方法、產(chǎn)品及其應(yīng)用。本發(fā)明的方法包括：在適合酶反應(yīng)的條件下，使甘油磷酸膽堿磷酸二酯酶和堿性磷酸酶同時(shí)或先后與樣品中的GPC接觸，從而降解GPC；對所得反應(yīng)產(chǎn)物中的無機(jī)磷進(jìn)行定量；根據(jù)所測定的無機(jī)磷含量確定所述待測樣品中甘油磷酸膽堿的含量。本發(fā)明的方法可用于高靈敏度和精確度的快速簡便降解和/或檢測GPC，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和酶工程領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及一種快速簡便降解或檢測甘油磷酸膽堿含量的酶學(xué)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

甘油磷酸膽堿(Glycerophosphocholine,GPC，結(jié)構(gòu)見下式)，是人體內(nèi)正常存在的水溶性小分子物質(zhì)。

GPC是重要神經(jīng)傳遞介質(zhì)乙酰膽堿(Acetylcholine)的生物合成前體，可以支持大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的功能。在體內(nèi)，GPC最重要的生理功能在于穿過血腦屏障，為乙酰膽堿和磷脂(PC)的合成提供必要的膽堿。而乙酰膽堿是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)傳遞介質(zhì)，其幫助腦部完成學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知活動，且能控制淺睡眠和肌動活動。

并且，作為一種磷脂類代謝產(chǎn)物,GPC在男性生殖系統(tǒng)的附辜組織及分泌液中具有相當(dāng)高的含量。近年來，國外許多研究表明精漿中GPC的含量約占人體GPC總量的90％以上，且絕大部分由附睪上皮分泌。精漿中GPC與精子在附睪內(nèi)發(fā)育成熟及受精等過程都密切相關(guān)(丁之德等，“我國正常生育力男性精漿中甘油-3-磷酸膽堿含量的研究”，生殖與避孕，1994,14(1):75-76)。由此提示GPC與男性生殖能力和健康的相關(guān)性。

作為生物體磷脂代謝中的一種重要物質(zhì)，GPC還與許多疾病存在一定的關(guān) 聯(lián)，如與腦缺血型中風(fēng)、老年癡呆、多發(fā)性腦梗死型癡呆、癌癥、阿爾茲海默癥等(例如參見Moestue S.A.等，“Glycerophosphocholine(GPC)is a poorly understood biomarker inbreast cancer(甘油磷酸膽堿(GPC)是乳腺癌中知之甚少的生物標(biāo)記物)”.PNAS.2012,109(38):E2506)。

近幾年，GPC在世界各國引起越來越多的關(guān)注(參見趙艷艷等，“甘油磷酸膽堿制備的研究進(jìn)展”，中國油脂，2013,38(12):50-52)。GPC藥物最早在意大利上市，目前已在意大利、波蘭、韓國、俄羅斯、希臘、智利、巴西等國家上市，在治療腦缺血型中風(fēng)、阿爾茨海默病、多發(fā)性腦梗死性癡呆等方面有顯著療效。

檢測GPC的早期方法包括例如：①使用酸法水解GPC使之產(chǎn)生膽堿，而后使用三碘化物沉淀膽堿并使用分光光度法進(jìn)行檢測(Dawso R.M.C.等，“Glycerylphosphorylcholine and phosphorylcholine in semen,and their relationto choline(精液中的甘油磷酸膽堿和磷酸膽堿及其與膽堿的關(guān)系)”Biochem.J.,1957,65:627-634)，該方法步驟較為復(fù)雜；②使用高碘酸鹽氧化GPC并加入甲醛產(chǎn)生生色物質(zhì)從而檢測GPC的方法，但是該方法需要去除果糖等一些雜質(zhì)等的影響；③先用色譜法純化GPC，而后通過反應(yīng)將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷，而后使用定磷法檢測磷含量從而得到GPC的量，但是樣品中其它磷脂類物質(zhì)會對結(jié)果產(chǎn)生干擾，而且其步驟也十分復(fù)雜(Chap J.H.等，“Simple,Rapid Enzymatic Determination of Glycerophosphocholine in HumanSeminal Plasma(人精漿中甘油磷酸膽堿的簡便快速酶法測定)”，Clin.Chem.1988，34(1):106-109)；等等。

相對于這些早期使用的化學(xué)法檢測，酶法檢測GPC具有十分顯著的優(yōu)點(diǎn)，譬如專一性高、檢測方法相對簡便、耗時(shí)短、無需進(jìn)行分離等優(yōu)點(diǎn)。